劉 彤，李 洋，李丹妮，耿楠希，李 豐

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室 教育部醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110001）

人p21活化激酶6基因截短區(qū)域的GST標(biāo)簽原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其重組蛋白的表達(dá)

劉 彤，李 洋，李丹妮＊，耿楠希，李 豐

（中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室 教育部醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110001）

目的：構(gòu)建人p21活化激酶6（PAK6）的各個截短區(qū)域原核表達(dá)質(zhì)粒，并誘導(dǎo)和鑒定其融合蛋白的表達(dá)，為探討PAK6基因的生物學(xué)功能提供依據(jù)。方法：以真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1－GFP－PAK6為模板，PCR擴(kuò)增出PAK6基因的各個截短片段。所獲得的各截短片段經(jīng)EcoRⅠ／XhoⅠ雙酶切后克隆至GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGEX－5X－1中。將構(gòu)建的PAK6各截短質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21中，采用IPTG誘導(dǎo)PAK6基因截短融合蛋白表達(dá)，采用Western blotting法鑒定PAK6基因截短融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果：EcoRⅠ／XhoⅠ雙酶切后得到與預(yù)期大小相符的載體片段（5 000bp）和PAK6 1－55（165bp）、PAK6 56－210（465bp）、PAK6 211－410（600bp）及PAK6 385－681（891bp）4個片段。Western blotting檢測，PAK6各截短區(qū)域質(zhì)粒GST－PAK6截短融合蛋白相對分子質(zhì)量分別為32 000、43 000、48 000和60 000。結(jié)論：成功構(gòu)建PAK6基因各個截短區(qū)域GST標(biāo)簽原核表達(dá)質(zhì)粒并表達(dá)其重組蛋白。

P21活化激酶；截短區(qū)域；原核表達(dá)質(zhì)粒；GST融合蛋白

人p21活化激酶 （p21－activated kinase，PAK）是保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，PAK為Rho家族小鳥苷三磷酸酶（Rho－GTPase）Cdc42／Rac1下游重要的靶蛋白，參與許多重要的細(xì)胞活動，如細(xì)胞骨架重建、細(xì)胞移動／遷移、細(xì)胞凋亡與生存和細(xì)胞周期與有絲分裂，而且與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移密切關(guān)聯(lián)［1－3］。PAK家族有6個成員，第1亞類包括PAK1～3，第2亞類包括PAK4～6。第1亞類成員含有自我抑制域，其激活依賴于上游Rho－GTPase，而第2亞類成員不含有自我抑制域，表達(dá)后具有持續(xù)的激酶活性［4－5］。PAK6為第2亞類PAK家族的成員之一，是雄激素受體的配體結(jié)合域上的氨基酸序列629～919通過酵母雙雜交識別篩選出來的雄激素受體關(guān)聯(lián)蛋白，主要表達(dá)于前列腺、睪丸和大腦等器官［6］。PAK6基因總長為2 055bp，編碼681個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量為75 000，N－端為高度保守的Rac／Cdc42相互作用結(jié)合域（CRIB），C－端是激酶域。文獻(xiàn)［7］報道：PAK6能夠同時與雄激素受體和雌激素受體相互作用，提示PAK6與激素類受體的生理學(xué)功能有關(guān)聯(lián)。PAK6在前列腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，尤其是在雄激素非依賴的情況下PAK6過表達(dá)尤為明顯［8］，說明PAK6在前列腺癌的惡性進(jìn)程中具有重要的作用。PAK6能夠磷酸化雄激素受體的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并以激酶依賴性方式抑制雄激素受體的轉(zhuǎn)錄激活作用［9］。本研究按照PAK6基因不同區(qū)域的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)構(gòu)建PAK6基因各個截短區(qū)域的原核表達(dá)質(zhì)粒，并誘導(dǎo)其GST標(biāo)簽融合蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步尋找與其特定區(qū)域相互結(jié)合的蛋白，為探討PAK6的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 pcDNA3.1－GFP－PAK6為美國Scripps研究院Bokoch惠贈；大腸桿菌BL－21感受態(tài)細(xì)胞、GST標(biāo)簽原核表達(dá)載體pGEX－5X－1購自美國Amersham Biosciences公司，GST單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司，PAK6商品化激酶購自美國Invitrogen公司，Glutathione SepharoseTM4B購自美國GE Healthcare公司，限制性內(nèi)切酶、PyrobestTMDNA polymerase、電泳凝膠回收試劑盒購自大連Takara公司，蛋白相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自美國MBI公司，DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自美國Takara公司，T4DNA連接酶購自英國NEB公司。引物序列合成和DNA序列測定由南京金斯瑞有限公司完成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 PAK6基因截短區(qū)域原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，分別在上游引物中引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，在下游引物中引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以pcDNA3.1－GFPPAK6質(zhì)粒為模板，利用PyrobestTMDNA polymerase和引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PAK6基因的截短片段，截短片段分別是1～55、56～210、211～410和385～681位氨基酸。將擴(kuò)增的截短片段利用EcoRⅠ／XhoⅠ酶切后連接到經(jīng)同樣酶切的pGEX－5X－1原核表達(dá)載體中。質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定證實(shí)構(gòu)建成功。構(gòu)建成功的質(zhì)粒命名為pGEX－5X－1－PAK6 1－55、pGEX－5X－1－PAK6 56－210、pGEX－5X－1－PAK6 211－410 和 pGEX－5X－1－PAK6 385－681。見表1。

表1 PAK6基因截短突變體引物序列Tab.1 The sequences of primers of truncated mutants of PAK6gene

1.3 PAK6基因截短區(qū)域重組表達(dá)蛋白的誘導(dǎo)和純化 將構(gòu)建成功的 pGEX－5X－1－PAK6 1～55、pGEX－5X－1－PAK6 56～ 210、pGEX－5X－1－PAK6 211～410 和 pGEX－5X－1－PAK6 385～681截短質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，加入1mmol·L－1IPTG，于30℃條件下振蕩培養(yǎng)3h，誘導(dǎo)GSTPAK6截短蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)后的細(xì)菌以4℃、6 000×g離心15min以沉淀細(xì)菌，加入1×SDS Loading buffer，重懸煮沸裂解；采用12%SDSPAGE電泳檢測GST－PAK6截短蛋白的表達(dá)。

1.4 Western blotting法鑒定重組蛋白的表達(dá) 將上述誘導(dǎo)表達(dá)后的蛋白經(jīng)12%SDS－PAGE凝膠分離后，恒流0.09mA轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，4℃過夜，用5%脫脂奶粉封閉3h，TBST洗膜15min×3次，加入GST抗體（1∶1 000），室溫孵育1h，TBST洗膜15min×3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）室溫孵育1h，TBST洗膜15min×3次，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色結(jié)果以是否出現(xiàn)特定蛋白條帶判定重組蛋白的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 PAK6基因截短區(qū)域原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定結(jié)果 PAK6基因1～55、56～210、211～410和385～681位氨基酸堿基片段長度分別為165、465、600 和 891bp。pGEX－5X－1－PAK6 1－55、pGEX－5X－1－PAK6 56－210、pGEX－5X－1－PAK6 211－410和 pGEX－5X－1－PAK6 385－681這4個表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ／XhoⅠ酶切后得到長度為5 000bp的載體片段，與預(yù)期大小相符，證明質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖1）。

2.2 PAK6基因截短區(qū)域原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX－5X－1－PAK6 1－55、 pGEX－5X－1－PAK6 56－210、pGEX－5X－1－PAK6 211－410 和 pGEX－5X－1－PAK6 385－681分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中。GST標(biāo)簽的蛋白相對分子質(zhì)量為26 000，與GST標(biāo)簽融合后1～55、56～210、211～410和385～681區(qū)域分別出現(xiàn)相對分子質(zhì)量為32 000、43 000、48 000和60 000左右的特異蛋白表達(dá)條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。見圖2。

2.3 PAK6基因截短融合蛋白的Western blotting鑒定 在相對分子質(zhì)量為32 000、43 000、48 000和60 000位置可見特異性結(jié)合抗體的條帶表達(dá)，說明成功表達(dá)了融合蛋白GST－PAK6 1－55、GSTPAK6 56－210、GST－PAK6 211－410和 GST－PAK6 385－681，與預(yù)期結(jié)果一致。見圖3。

圖1 PAK6基因4個截短區(qū)域的原核表達(dá)質(zhì)粒酶切電泳圖Fig.1 Electrophoregram of enzyme digestion of prokaryotic expression plasmids of four truncated regions of PAK6gene

圖2 PAK6基因4個截短區(qū)域原核表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of prokaryotic expression plasmids of four truncated regions of PAK6gene in E.coli BL21

圖3 Western blotting法鑒定GST－PAK6截短融合蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of GST－PAK6 truncated fusion proteins detected by Western blotting method

3 討 論

PAK6基因是PAK家族中最晚發(fā)現(xiàn)的一個成員，其生物學(xué)功能并未像家族其他成員一樣研究的比較詳盡。目前，PAK6基因的主要功能是與雄激素受體相互作用并通過磷酸化調(diào)節(jié)雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性［6－7］。在前列腺、睪丸和大腦中PAK6基因表達(dá)水平較高，并且在前列腺癌，尤其是雄激素去勢治療后的復(fù)發(fā)性前列腺癌中呈高表達(dá)［8］。過度表達(dá)并維系PAK6激酶活性可降低腫瘤細(xì)胞對放療和化療的敏感性，導(dǎo)致前列腺癌發(fā)病和發(fā)生激素非依賴 性 的 改 變［10－11］。 最 新 的 研 究［12］表 明：PAK6在正常生理情況下通過磷酸化雄激素受體和腫瘤E3連接酶Mdm2以泛素化途徑降解雄激素受體以維持其穩(wěn)態(tài)，從而負(fù)向調(diào)節(jié)前列腺腫瘤的生長。上述研究提示PAK6基因在惡性前列腺癌尤其是復(fù)發(fā)性前列腺癌中是一個具有重要治療意義的分子靶位。此外，動物實(shí)驗(yàn)中，PAK6基因敲除鼠雖未表現(xiàn)出胚胎致死的癥狀，但其與裸鼠的體質(zhì)量增長有密切的關(guān)聯(lián)［13］；PAK6基因也在小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力方面起重要作用［14］。研究提示PAK6基因具有重要的生理學(xué)作用。

本研究根據(jù)PAK6基因序列特點(diǎn)分成4個截短區(qū)域，其中1～55區(qū)域氨基酸包含CRIB區(qū)域，其中可能包含有核定位相關(guān)的信號序列［15－16］。56～210區(qū)域氨基酸為PAK6N端的調(diào)節(jié)區(qū)域，而211～410區(qū)域氨基酸為鉸鏈結(jié)構(gòu)域，許多與PAK6基因相互作用的蛋白都可能結(jié)合至該結(jié)構(gòu)域中。385～681區(qū)域氨基酸包含PAK6功能結(jié)構(gòu)域即激酶結(jié)構(gòu)域。不同的PAK6相互作用蛋白可能結(jié)合于PAK6基因不同區(qū)域，因此構(gòu)建PAK6基因截短區(qū)域的表達(dá)質(zhì)粒可用于篩選相互作用蛋白并研究其特定功能。本研究為進(jìn)一步鑒定PAK6基因的生理學(xué)功能提供了可能的依據(jù)。

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＊中國醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)七年制94期

Construction of GST－tagged prokaryotic expression plasmids of human PAK6gene and expressions of their recombinant proteins

LIU Tong，LI Yang，LI Dan－ni＊，GENG Nan－xi，LI Feng
（Department of Cell Biology，School of Basic Science，Key Laboratory of Medical Cell Biology，Ministry of Education，China Medical University，Shenyang 110001，China）

Objective To construct the prokaryotic expression plasmids of truncated regions of human p21－activated kinase 6（PAK6）to induce and identify their recombinant proteins，and to provide basis for discussing the biological function of PAK6gene.Methods The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1－GFP－PAK6was used as the template，and the truncated segments of PAK6gene were amplified by PCR method.The truncated segments were cloned into GST－tagged prokaryotic expression vector pGEX－5X－1after double enzyme digestion ofEcoRⅠ／XhoⅠ.The truncated plasmids were transfected intoE.coliBL21and the PAK6gene truncated fusion proteins were induced by IPTG and verified by Western blotting method.Results The vector fragment（5 000bp）and PAK6 1－55（165bp），PAK6 56－210（465bp），PAK6 211－410（600bp），and PAK6 385－681（891bp）vector fragments being consistent with the expected fragments were obtained after double enzyme digestion ofEcoRⅠ／XhoⅠ.The Western blotting results showed that the relative molecular mass of GST－PAK6truncated fusion proteins of PAK6 truncated region plasmids were 32 000，43 000，48 000，and 60 000，respectively.Conclusion GST－tagged prokaryotic expression plasmids of different truncated regions of PAK6gene are constructed and their recombinant proteins are expressed successfully.

p21－activated kinase 6；truncated region；prokaryotic expression plasmid；GST fusion protein

R736

A

1671－587Ⅹ（2013）03－0437－04

10.7694／jldxyxb20130303

2013－03－12

國家自然科學(xué)基金資助課題 （31171360）

劉 彤 （1980－），女，遼寧省沈陽市人，講師，醫(yī)學(xué)博士，主要從事腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的研究。

李 豐 （Tel：024－23261056，E－mail：fli＠m(xù)ail.cmu.edu.cn）