甄永占，林雅軍，章廣玲，林小虎，王梅梅，李 冉，魏靜波

（1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 唐山 063000；2.衛(wèi)生部北京醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100730；3.河北省遷西縣人民醫(yī)院胸外科，河北 唐山 064300）

賴氨大黃酸和紫杉醇對肺癌細(xì)胞增殖的抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用

甄永占1，林雅軍2，章廣玲1，林小虎3，王梅梅1，李 冉1，魏靜波1

（1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河北 唐山 063000；2.衛(wèi)生部北京醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100730；3.河北省遷西縣人民醫(yī)院胸外科，河北 唐山 064300）

目的：研究賴氨大黃酸（RHL）、紫杉醇單獨(dú)和兩者聯(lián)合對人肺癌H460細(xì)胞增殖和凋亡的影響，闡明其作用機(jī)制。方法：選取處于對數(shù)生長期肺癌細(xì)胞株H460，隨機(jī)分為對照組（不加藥物）、紫杉醇組（1μmol·L－1紫杉醇）、RHL組（100μmol·L－1RHL）和紫杉醇聯(lián)合RHL組，并設(shè)空白組。采用 MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測各組處理后48h的細(xì)胞增殖率和凋亡率；采用Western blotting方法檢測凋亡相關(guān)蛋白和MEK／ERK蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：細(xì)胞培養(yǎng)48h后，聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖率顯著低于對照組、紫杉醇組和RHL組 （P＜0.05），聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組、紫杉醇組和RHL組（P＜0.05），聯(lián)合用藥組caspase－3和poly ADP－ribose polymerase（PARP）的切割片段蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對照組、紫杉醇組和RHL組，聯(lián)合用藥組Bcl－2和NF－κB蛋白表達(dá)強(qiáng)度明顯低于對照組、紫杉醇組和RHL組，同時RHL組紫杉醇上調(diào)的MEK和ERK蛋白磷酸化強(qiáng)度降低。結(jié)論：紫杉醇和RHL均可抑制肺癌H460細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；RHL通過降低ERK活性、上調(diào)caspase－3和PARP的切割片段蛋白表達(dá)，增強(qiáng)紫杉醇抑制肺癌細(xì)胞增殖和凋亡誘導(dǎo)作用。

賴氨大黃酸；紫杉醇；肺癌；細(xì)胞凋亡；聯(lián)合用藥

大黃酸是傳統(tǒng)中藥大黃中的一個重要蒽醌類化合物，可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，具有廣泛的生物學(xué)活性［1－3］。蒽醌類化合物的共同特點(diǎn)是不溶于水，因此限制了其在腫瘤治療方面的應(yīng)用。目前國內(nèi)外多采用不溶于水的大黃酸進(jìn)行研究，本實(shí)驗(yàn)室對大黃酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，獲得了水溶性好的賴氨大黃酸（rhein lysinate，RHL），與大黃酸比較，RHL溶解度提高為8g·L－1［1］。本研究觀察RHL聯(lián)合紫杉醇對人肺癌H460細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制，為大黃酸在腫瘤治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 人肺癌細(xì)胞株（H460）由本室傳代保存。使用前用含10%胎牛血清（Hyclone）的高糖DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司），置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，2d傳代1次，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為對數(shù)生長期細(xì)胞。RHL由本室合成，分子式為C21H22N2O8，相對分子質(zhì)量為430，純度93%。主要試劑：賴氨酸為北京市科海軍舟生物科技發(fā)展中心產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)用紫杉醇（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所），蛋白定量試劑盒（BCATMprotein assay kit，Pierce公司產(chǎn)品），寬范圍蛋白預(yù)染 Marker（New England Biolabs公司），蛋白質(zhì)印跡發(fā)光液和PVDF膜（Millipore公司），F(xiàn)ITC－AnnexinⅤ 凋亡檢測試劑盒（北京寶賽生物技術(shù)有限公司），β－actin抗體sc－1616（Santa Cruz公司），HRP標(biāo)記的羊抗兔、兔抗羊和羊抗小鼠IgG抗體（北京中杉金橋有限責(zé)任公司），絲裂原活化蛋白激酶家族成員抗體試劑盒，磷酸化絲裂原活化蛋白激酶家族成員抗體試劑盒和凋亡信號通路試劑盒（Cell Signaling Technology公司）。

1.2 細(xì)胞增殖活性檢測 應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞存活率。取對數(shù)生長期細(xì)胞，輕輕吹打分散成細(xì)胞懸液，記數(shù)后以每孔4×103密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入200μL培養(yǎng)液，24h后各組分別加入相應(yīng)的藥物：紫杉醇組加入1μmol·L－1紫杉醇，RHL組加入100μmol·L－1RHL，紫杉醇聯(lián)合 RHL組加入1μmol·L－1紫杉醇和100μmol·L－1RHL，實(shí)驗(yàn)設(shè)無細(xì)胞對照孔和無藥對照孔各3孔，空白組無細(xì)胞、無藥物，對照組有細(xì)胞，但無藥物。繼續(xù)培養(yǎng)48h，每組至少3個平行孔。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前加入5g·L－1MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后小心吸去上清液，加入二甲基亞砜150mL，振蕩溶解結(jié)晶后用酶標(biāo)儀（Thermo Labsystems公司，Multiskan MK3）于570nm處測定每個孔的吸光度（A570）值。按下面公式計(jì)算細(xì)胞的增殖率：細(xì)胞增殖率 ＝（加藥組A570值－空白組A570值）／（對照組 A570值－空白組 A570值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 Annexin V－FITC／PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期細(xì)胞3mL，按每孔5×104接種于6孔板，24h后各組分別加入相應(yīng)的藥物：紫杉醇組加入1μmol·L－1紫杉醇，RHL組加入100μmol·L－1RHL，紫杉醇聯(lián)合RHL組加入1μmol·L－1紫杉醇和100μmol·L－1RHL，對照組不加藥物，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，將待測細(xì)胞數(shù)調(diào)整為（5～10）×108L－1，取1mL細(xì)胞于4℃、1 000r·min－1離心10min，棄上清液，PBS洗滌，將細(xì)胞重懸于binding buffer 300μL，加入 Annexin V／FITC 10μL，輕輕搖勻，室溫反應(yīng)1h，加入PI 5μL輕輕搖勻，室溫反應(yīng)15min，細(xì)胞經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾后，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果以細(xì)胞凋亡率表示。

1.4 蛋白質(zhì)提取及 Western blotting檢測 分別收集1μmol·L－1紫杉醇組、100μmol·L－1RHL組、1μmol·L－1紫杉醇和100μmol·L－1RHL聯(lián)合用藥組作用48h和未加藥處理的H460細(xì)胞，用預(yù)冷的1×PBS洗3遍，加入新鮮配制的細(xì)胞裂解液（50mmol·L－1Tris－HCl，pH 7.5；1%NP－40；150mmol·L－1NaCl；1mmol·L－1Na3VO4；1mmol·L－1NaF，使用前加入3種蛋白酶抑制劑：1% 抑蛋白酶肽、10g·L－1亮抑酶肽和1mmol·L－1苯甲基磺酰氟）100μL，細(xì)胞與裂解液充分混合，冰浴20min。于4℃、13 000r·min－1離心15min，收集上清液于新的微量離心管中，采用BCA法測定蛋白表達(dá)水平。取各樣品等量總蛋白30μg加入0.25倍體積的5×上樣緩沖液，煮沸變性5min后，在10%十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate－polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE）膠上進(jìn)行電泳。電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，1%BSA封閉1h，一抗4℃孵育過夜后，加相應(yīng)二抗孵育2h，膜上滴加化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑（Santa Cruz biotechnology SC－2048），按照試劑盒說明進(jìn)行操作，結(jié)果在凝膠成像儀上照相并使用Bio－Rad公司Quantity One分析軟件測量條帶灰度值，目的條帶與β－actin條帶灰度值比值即為該目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組細(xì)胞增殖率、細(xì)胞凋亡率以（±s）%表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 紫杉醇和RHL單獨(dú)或聯(lián)合作用后細(xì)胞增殖率 H460細(xì)胞給藥48h后，紫杉醇聯(lián)合RHL組細(xì)胞增殖率明顯低于紫杉醇組和RHL組（P＜0.05）；紫杉醇和RHL單獨(dú)用藥組細(xì)胞增殖率低于對照組（P＜0.05）。紫杉醇和RHL聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖抑制作用明顯高于紫杉醇和RHL單藥組。見表1。

表1 各組H460細(xì)胞增殖率Tab.1 The proliferation rates of H460cells in various groups ［n＝3，（±s）／%］

表1 各組H460細(xì)胞增殖率Tab.1 The proliferation rates of H460cells in various groups ［n＝3，（±s）／%］

＊P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs RHL group；＃P＜0.05 vs taxol group.

Group Cell proliferation rate Control 100.0±0.0 Taxol 54.2±3.3＊RHL 54.9±3.8＊Taxol combined with RHL 11.8±1.2＊△＃

2.2 紫杉醇和RHL單獨(dú)或聯(lián)合作用后細(xì)胞凋亡率 紫杉醇組和RHL組的細(xì)胞凋亡率分別為18.9%±1.3%和21.1%±1.6%，與對照組的凋亡率（3.1%±0.6%）比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），紫杉醇聯(lián)合RHL組細(xì)胞凋亡率為53.3%±1.9% ，與紫杉醇和RHL單獨(dú)用藥組凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.3 Western blotting法檢測紫杉醇和RHL單獨(dú)或聯(lián)合作用細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)強(qiáng)度 紫杉醇聯(lián) 合 RHL 組 poly ADP－ribose polymerase（PARP）和caspase－3的切割片段蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于紫杉醇組和RHL組，而紫杉醇聯(lián)合RHL組Bcl－2和NF－κB的表達(dá)強(qiáng)度低于紫杉醇組和RHL組。見圖2。

圖1 各組H460細(xì)胞凋亡率檢測流式細(xì)胞圖Fig.1 Flow cytometry graph of apoptotic rates detection of H460cells in various groups

2.4 Western blotting法檢測紫杉醇和RHL單獨(dú)或聯(lián)合作用細(xì)胞后MEK和ERK蛋白的表達(dá)強(qiáng)度紫杉醇組磷酸化MEK和ERK蛋白表達(dá)強(qiáng)度高于對照組，RHL組磷酸化的MEK和ERK蛋白表達(dá)強(qiáng)度與對照組比較無明顯變化，而紫杉醇聯(lián)合RHL組磷酸化的MEK和ERK的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于單獨(dú)應(yīng)用紫杉醇組。見圖3。

圖2 Western blotting法檢測H460細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of apoptosis－related proteins of H460cells detected by Western blotting method

圖3 Western blotting法檢測H460細(xì)胞中MEK和ERK蛋白表達(dá)電泳圖Fig.3 Electrophoregram of expressions of MEK and ERK proteins in H460cells detected by Western blotting method Lane 1：Control group；Lane 2：Taxol group；Lane 3：RHL group；Lane 4：Taxol combined with RHL group.

3 討 論

肺癌是對人類威脅最大的惡性腫瘤之一，已位居我國惡性腫瘤死亡率第1位，在許多國家也是首位的癌癥致死原因，其發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢。化療在肺癌的綜合治療中占據(jù)著重要的地位。紫杉醇作為肺癌化療中常用藥物，雖有一定的效果，但仍不夠理想，而且其對正常組織的毒性又常常導(dǎo)致患者不能長期堅(jiān)持用藥，故尋找高效低毒的腫瘤化療增敏劑以增強(qiáng)紫杉醇的化療效果，改善患者的生存率成為研究熱點(diǎn)。

大黃酸是許多中藥 （尤其是大黃）的主要有效成分，可抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，具有廣泛的生物學(xué)活性［1－3］。對大黃酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造獲得了水溶性較高的RHL。本研究結(jié)果顯示：紫杉醇和RHL均能抑制肺癌H460細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，但兩藥聯(lián)合后增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用顯著高于單用紫杉醇或RHL。

細(xì)胞發(fā)生凋亡的過程中，caspases家族蛋白酶在凋亡信號傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵性的作用。為了保持凋亡程序的正常進(jìn)行，caspases在細(xì)胞中最初是以前體形式存在的。當(dāng)起始caspases（initiator caspases）如caspase－8和caspase－9通過形成寡聚體被激活后，就可以發(fā)揮切割效應(yīng)caspases（effector caspases） 如 caspase－3、caspase－6 和caspase－7［4－6］。激活的效應(yīng)caspases反過來又可以切割一系列特異的細(xì)胞底物，caspases最主要的底物是PARP，該酶與DNA修復(fù)、基因完整性監(jiān)護(hù)有關(guān)。在細(xì)胞凋亡啟動時，相對分子質(zhì)量為116 000的PARP被剪切成2個相對分子質(zhì)量為31 000和85 000片段，結(jié)果使受PARP負(fù)調(diào)控影響的核酸內(nèi)切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，引起細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示：兩藥聯(lián)合進(jìn)一步增加了H460細(xì)胞caspase－3和PARP的切割片段蛋白表達(dá)強(qiáng)度，因此可以推斷RHL能夠通過調(diào)控caspases家族增強(qiáng)紫杉醇對H460細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。另外，為了進(jìn)一步探討兩藥聯(lián)合的分子機(jī)制，本研究還觀察了Bcl－2和NF－κB蛋白表達(dá)強(qiáng)度的變化，兩藥聯(lián)合顯著下調(diào)了Bcl－2和NF－κB蛋白的表達(dá)水平。

NF－κB是一種與腫瘤生成有關(guān)的生存因子，其活化會使腫瘤細(xì)胞最終對凋亡產(chǎn)生抗性［7－10］。Bcl－2是一種抗凋亡蛋白，可以通過與Bax形成異源二聚體而起到抗凋亡作用，研究［9，11］認(rèn)為：Bax與Bcl－2的表達(dá)比例決定細(xì)胞的生存與凋亡。同時RHL還能降低紫杉醇上調(diào)的MEK和ERK蛋白磷酸化強(qiáng)度。ERK的激活有利于細(xì)胞生存，也是腫瘤耐藥的常見原因［12－16］。

綜上所述，RHL能夠通過抑制紫杉醇對MEK和ERK的激活增強(qiáng)紫杉醇對肺癌細(xì)胞增殖和凋亡誘導(dǎo)作用，提示RHL不僅自身有抗肺癌作用，而且還可以增強(qiáng)紫杉醇對肺癌H460細(xì)胞的殺傷作用和凋亡誘導(dǎo)作用，減少毒副作用。進(jìn)一步研究RHL和紫杉醇兩者聯(lián)合治療肺癌的作用機(jī)制和作用途徑，可能為肺癌的綜合治療提供新思路、新線索和新方法。

［1］Lai WW，Yang JS，Lai KC，et al.Rhein induced apoptosis through the endoplasmic reticulum stress，caspase－and mitochondria－dependent pathways in SCC－4human tongue squamous cancer cells ［J］.In Vivo，2009，23 （2）：309－316.

［2］Ip SW，Weng YS，Lin SY，et al.The role of Ca2＋on rheininduced apoptosis in human cervical cancer CaSki cells［J］.Anticancer Res，2007，27 （1A）：379－389.

［3］Lin ML，Chen SS，Lu YC，et al.Rhein induces apoptosis through induction of endoplasmic reticulum stress and Ca2＋－dependent mitochondrial death pathway in human nasopharyngeal carcinoma cells［J］.Anticancer Res Nat Rev Drug Discov，2007，27 （5A）：3313－3322.

［4］Enari M，Sakahira H，Yokoyama H，et al.A caspaseactivated DNase that degrades DNA during apoptosis，and its inhibitor ICAD［J］.Nature，1998，391 （6662）：43－50.

［5］Fiandalo MV，Kyprianou N.Caspase control：protagonists of cancer cell apoptosis［J］.Exp Oncol，2012，34 （3）：165－175.

［6］Fan TJ，Han LH，Cong RS，et al.Caspase family proteases and apoptosis ［J］. Acta Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2005，37 （11）：719－727.

［7］Sohma I，F(xiàn)ujiwara Y，Sugita Y，et al.Parthenolide，an NF－κB inhibitor，suppresses tumor growth and enhances response to chemotherapy in gastric cancer ［J］. Cancer Genom Proteom，2011，8 （1）：39－47.

［8］Hayashi S，Sakurai H，Hayashi A，et al.Inhibition of NF－kappaB by combination therapy with parthenolide and hyperthermia and kinetics of apoptosis induction and cell cycle arrest in human lung adenocarcinoma cells ［J］.Int J Mol Med，2010，25 （1）：81－87.

［9］Wang Y，Wang X，Zhao H，et al.Clusterin confers resistance to TNF－alpha－induced apoptosis in breast cancer cells through NF－kappaB activation and Bcl－2 overexpression［J］.J Chemother，2012，24 （6）：348－357.

［10］Yu JA，Kalatardi S，Dohse J，et al.Group IIa sPLA2 inhibition attenuates NF－κB activity and promotes apoptosis of lung cancer cells［J］.Anticancer Res，2012，32 （9）：3601－3607.

［11］劉 安 恒，曹 亞 南，張 衛(wèi) 衛(wèi)，等.DIDS 對 Bcl－2／Bax 在staurosporine誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中表達(dá)的影響 ［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2009，25 （1）：47－50.

［12］Ozaki K，Kosugi M，Baba N，et al.Blockade of the ERK or PI3K－Akt signaling pathway enhances the cytotoxicity of histone deacetylase inhibitors in tumor cells resistant to gefitinib or imatinib ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391 （4）：1610－1615.

［13］Ko JC，Su YJ，Lin ST，et al.Emodin enhances cisplatininduced cytotoxicity via down－regulation of ERCC1and inactivation of ERK1／2 ［J］.Lung Cancer，2010，69 （2）：155－164.

［14］Pelaia G，Gallelli L，Renda T，et al.Effects of statins and farnesyl transferase inhibitors on ERK phosphorylation，apoptosis and cell viability in non－small lung cancer cells［J］.Cell Prolif，2012，45 （6）：557－565.

［15］Sancho P，Galeano E，Esta? MC，et al.Raf／MEK／ERK signaling inhibition enhances the ability of dequalinium to induce apoptosis in the human leukemic cell line K562 ［J］.Exp Biol Med（Maywood），2012，237 （8）：933－942.

［16］付軍科，吳齊飛，張 勇.靶向下調(diào)FoxM1基因表達(dá)對肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響 ［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，34 （1）：64－67.

Inhibitory effects on proliferation and induction of apoptosis of lung cancer cells of rhein lysinate and taxol

ZHEN Yong－zhan1，LIN Ya－jun2，ZHANG Guang－ling1，LIN Xiao－h(huán)u3，WANG Mei－mei2，LI Ran1，WEI Jing－bo1
（1.Department of Histology and Embryology，College of Basic Medicine，Hebei United University，Tangshan 063000，China；2.Beijing Hospital ＆Beijing Institute of Geriatrics，Ministry of Health，Beijing 100730，China；3.Department of Thoracic Surgery，People’s Hospital of Qianxi County，Tangshan 064300，China）

Objective To investigate the effects of rhein lysinate（RHL），taxol and their combination on the proliferation and apoptosis of lung cancer H460cells，and to clarify their mechanisms.Methods The lung cancer H460cells in logarithm growth phase were selected and randomly divided into control group（adding no drug），taxol group（1μmol·L－1taxol），RHL group（100μmol·L－1RHL）and taxol combined with RHL group；at the same time，blank control group was set up.MTT assay was used to detect the proliferation of H460cells and flow cytometry method was used to analyze the apoptotic rates in various groups 48hafter treatment.The expression levels of apoptosis－related proteins and MEK／ERK proteins were detected by Western blotting method.Results After culture for 48h，the cell proliferation rate in taxol combined with RHL group was lower than those in control，taxol，and RHL groups（P＜0.05）；the apoptotic rate in taxol combined with RHL group was higher than those in control，taxol，and RHL groups（P＜0.05）；the expressions of caspase－3and poly ADP－ribose polymerase（PARP）fragment protein in taxol combined with RHL group were higher than those in control，taxol，and RHL groups；whereas the expressions of Bcl－2and NF－κB proteins were lower than those in control，taxol，and RHL groups.Moreover，the phosphorylation levels of MEK and ERK proteins up－regulated by taxol in RHL group were decreased.Conclusion Both taxol and RHL can inhibit cell proliferation and induce apoptosis of lung cancer H460cells，and RHL can enhance the taxol－induced cytotoxicity and apoptosis by reducing the activity of ERK and increasing the expression levels of caspase－3and PARP fragment protein.

rhein lysinate；taxol；lung cancer；apoptosis；combination therapy

R734.2

A

1671－587Ⅹ（2013）03－0432－05

10.7694／jldxyxb20130302

2012－12－19

國家自然科學(xué)基金資助課題 （81001439）；河北省自然科學(xué)基金資助課題 （H2012401030）

甄永占 （1970－），女，河北省唐山市人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事腫瘤分子藥理學(xué)研究。

林雅軍 （Tel：010－58115040，E－mail：linyajun2000＠126.com）