成澤東,陳以國,張濤

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溫和灸神闕穴對慢性疲勞大鼠腸道菌群的影響

成澤東,陳以國,張濤

(遼寧中醫(yī)藥大學,沈陽 110032)

觀察溫灸神闕穴對慢性疲勞大鼠腸道菌群的影響。將40只大鼠隨機分為正常組、模型組、人參皂甙組、神闕組,每組10只。用飲食失節(jié)加冷水游泳制備慢性疲勞大鼠模型,人參皂甙組采用人參皂甙水溶液灌胃治療,神闕組采用溫灸神闕穴治療。21 d后采用厭氧及需氧菌選擇性培養(yǎng)基測定各組大鼠糞便中典型菌群數(shù)量。與正常組比較,模型組菌群數(shù)量明顯減少(＜0.05);與模型組相比較,神闕組和人參皂甙組菌群數(shù)量明顯增加(均＜0.05);神闕組與人參皂甙組菌群數(shù)量與正常組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(＞0.05)。慢性疲勞可引起腸道菌群失調(diào),溫灸神闕穴可改善由慢性疲勞引起的腸道菌群失調(diào)。

灸法;穴,神闕;疲勞綜合征,慢性;腸道菌群;大鼠;艾條灸

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrom,CFS)是指以慢性疲勞持續(xù)或反復發(fā)作6個月以上為主要表現(xiàn),同時伴有低熱、頭痛、咽喉痛、肌痛、神經(jīng)精神癥狀等非特異性癥狀的癥候群。1987年由美國疾病控制中心(CDC)正式命名。目前現(xiàn)代醫(yī)學對CFS的發(fā)病機制不十分明確,臨床缺乏有效的治療藥物。灸法作為一種綠色療法在防治亞健康方面有其突出的優(yōu)勢[1-3]。本實驗采用飲食失調(diào)加冷水游泳的方法建立慢性疲勞大鼠模型,觀察溫灸神闕穴對模型大鼠腸道菌群數(shù)量的影響,探討其對CFS的治療作用及對腸道菌群的調(diào)整作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級SD大鼠40只,雌雄各半,體重為(200±20)g,由遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器、試劑及藥品

艾條(南陽漢醫(yī)艾絨有限責任公司),人參皂甙散(集安萬泰參業(yè)生物有限公司),TPY瓊脂,MRS瓊脂,山梨醇麥康凱瓊脂,Pfizer選擇性腸球菌(EC)瓊脂,高壓滅菌器(三洋SANYOMLS-3780),厭氧產(chǎn)氣袋,氧氣指示劑,2.5 L密封培養(yǎng)罐(三菱瓦斯化學株式會社),JA系列電子天平。

1.3 分組及造模

將40只大鼠隨機分為正常組、模型組、人參皂甙組、神闕組,每組10只。參照孟宏[4]等的造模方法,即模型組、人參皂甙組、神闕組采用飲食失節(jié)加冷水游泳,單日食大白菜,不限量,雙日灌精煉豬油,每日2次,每次2 mL,同時每日在水溫21℃左右的水中游泳30 min。

1.4 治療方法

正常組和模型組不給予任何治療,每只每日空手抓1次,以保持與兩治療組一致。神闕組和人參皂甙組在造模的同時開始治療。神闕組大鼠仰臥位固定,選定穴位局部脫毛,點燃直徑4 mm的艾條垂直距神闕穴2～4 cm處給予溫和灸[5],每日于巳時開始灸10 min,連續(xù)21 d。人參皂甙組采用人參皂甙水溶液(70 mg/kg/d)灌胃治療,每日1次,連續(xù)21 d。

1.5 取材與樣品制備

各組大鼠均被迫采取新鮮糞便0.1 g,置于含0.9 mL生理鹽水稀釋液和玻璃珠的無菌小瓶內(nèi)(質(zhì)量濃度為1:10),200次/min振蕩15 min。

1.5.1 培養(yǎng)基制備

①66.24 gMRS乳酸桿菌(LBS)選擇瓊脂溶入1000 mL蒸餾水配比,并用吸管加入1.32 mL冰乙酸,混勻,加熱溶解,不停攪拌,冷至50℃,傾注滅菌培養(yǎng)皿備用;②46.4 gTPY雙歧桿菌(BS)瓊脂溶入1000 mL蒸餾水配比,分裝入三角瓶,于121℃高壓滅菌15 min,傾入無菌培養(yǎng)皿備用;③58 gPfizer選擇性腸球菌(EC)瓊脂溶入1000 mL蒸餾水配比,分裝入三角瓶,于121℃高壓滅菌15 min,傾入無菌平皿備用;④55 g山梨醇麥康凱瓊脂溶入1000 mL蒸餾水配比,分裝入三角瓶,于121℃高壓滅菌15 min,冷至50℃,每20 mL加入0.05%無菌亞碲酸鉀溶液1 mL,傾入無菌培養(yǎng)皿備用。

1.5.2 細菌培養(yǎng)

將振蕩好的每份標本各取40mL,分別滴種于MRS乳酸桿菌(LBS)選擇瓊脂培養(yǎng)基、TPY雙歧桿菌(BS)瓊脂培養(yǎng)基、Pfizer腸球菌(EC)瓊脂培養(yǎng)基、山梨醇麥康凱腸桿菌(EMB)瓊脂培養(yǎng)基,用L型棒推勻。自高稀釋度向低稀釋度滴種,進行10倍稀釋至10－6,選擇10－4～10－6,每個稀釋度向相應培養(yǎng)基滴種2滴,滴管液體量為1/47 mL。將滴種好的培養(yǎng)基靜止20 min后,將EMB、EC置于37℃的溫箱中,需氧培養(yǎng)24 h,BS、LBS放入?yún)捬豕拗?加入?yún)捬醍a(chǎn)氣袋和氧氣指示劑,置于37℃溫箱中,厭氧培養(yǎng)48～72 h。

1.6 觀察指標

將各組培養(yǎng)基所長益生菌分別溶于4 mL蒸餾水中,采用比濁法使用酶標儀分別計各組菌落OD值,進行組間差異比較。并同時將各組培養(yǎng)生長的細菌革蘭染色。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

由表1可見,與正常組比較,模型組菌群數(shù)量明顯減少(＜0.05);與模型組相比較,神闕組和人參皂甙組菌群數(shù)量均明顯增加(＜0.05);神闕組與人參皂甙組菌群數(shù)量與正常組比較,差異均無統(tǒng)計學意義(＞0.05)。

表1 各組大鼠腸道菌群定量檢測結果比較(n=10)(±s,lg cfu/mL)

注:與正常組比較1)＜0.05;與模型組比較2)＜0.05

3 討論

腸道菌群是影響人體健康的重要因素之一,在人體的胃腸道中形成一個十分復雜而又相對穩(wěn)定的微生物區(qū)系。這個區(qū)系棲息的微生物種類繁雜,以腸道細菌多見,數(shù)量可達1014個左右,它們構成了人體胃腸道的生物學屏障[6]。存在于腸道的典型菌群為乳酸桿菌(LBS)、雙歧桿菌(BS)、大腸桿菌(EMB)和腸球菌(EC)等,在一般情況下,這些微生物互相依存,互相制約,維持平衡,保持一定的數(shù)量和比例。腸道菌群的正常組合遭到破壞,就會出現(xiàn)胃腸不適等病理表現(xiàn),久之,便會使消化、吸收功能降低,出現(xiàn)中醫(yī)學脾虛證的證候,進而導致慢性疲勞的發(fā)生;反之,由慢性疲勞造成的脾虛同樣可能引起腸道菌群失調(diào)。

目前CFS尚無明確的病因病機,故亦無治療CFS的特效藥物?；诙嗄陙韺FS的疲勞和應激學說的研究,采用抗疲勞,抗應激,提高機體免疫力的方法治療CFS,取得了一些較顯著的成效。人參具有促腎上腺皮質(zhì)激素樣和促性激素樣作用,在應激過程中能明顯提高機體的耐受力。臨床觀察發(fā)現(xiàn)人參具有強心,提高記憶力,增強免疫力,抗輻射,降低膽固醇等功效。從人參中提取出來的人參皂苷粉是一個多糖總成分,對免疫力低下、疲勞、心腦血管疾病、精神疲乏、癌癥等都有很好的改善作用。人參皂甙對神經(jīng)系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)作用,能興奮垂體-腎上腺系統(tǒng),增強機體應激反應能力,具有抗疲勞、抗休克作用,能提高機體免疫力。而且人參皂甙能提升胸腺T淋巴細胞ConA增殖反應及增強NK細胞活性。所以,人參皂甙為目前公認的抗疲勞、抗應激藥物,因此本研究選用人參皂甙散作為陽性對照藥。

《厘正按摩要術》:“臍通五臟,真氣往來之門也,故曰神闕。”肚臍是主腎交通的“門戶”,與人體經(jīng)脈和五臟六腑有著密切的生理、病理聯(lián)系。臍又稱“環(huán)谷”,與腹膜直接相連,與大腸、小腸、肝、脾、胃、膽、胰等中下焦臟腑距離很近。灸神闕穴主要通過艾的溫通作用與火的陽熱屬性刺激穴位,疏通經(jīng)絡,調(diào)理脾氣,從而達到補虛瀉實,調(diào)整臟腑陰陽,使人體各種機能趨于平衡,達到康體愈病的目的。

目前大多數(shù)中醫(yī)微生態(tài)學研究還是基于藥物治療方面的,如嚴梅楨等[7]用黃芪水煎液灌喂老齡小鼠,結果表明黃芪能使衰老小鼠紊亂的腸道菌群得以調(diào)整。田碧文等[8]選用了15種傳統(tǒng)抗衰老中藥對雙歧桿菌(BS)進行了體外生長促進實驗,結果發(fā)現(xiàn)刺五加、五味子、寧夏枸杞子及阿膠對嬰兒雙歧桿菌(BS)有明顯的促進作用。本研究發(fā)現(xiàn),神闕灸可增加腸道中雙歧桿菌(BS)、乳酸桿菌(LBS)兩種厭氧菌的菌群數(shù)量;腸桿菌(EMB)、腸球菌(EC)兩種需氧菌的菌群數(shù)量。說明神闕灸可改善大鼠腹瀉癥狀,調(diào)整由慢性疲勞引起的腸道菌群失調(diào)。

[1] Huang QF, Wu HG, Liu J,. Bibliometric analysis of diseases spectrum of moxibustion therapy[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2012, 10(6):342-348.

[2] Zeng R, Tang JL. Clinical study on tuina and moxibustion for chronic fatigue syndrome[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2012, 10(5):296-299.

[3] Sun DL, Zhang Y, Chen DL,. Effect of moxibustion therapy plus cupping on exercise-induced fatigue in athletes[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2012, 10(5):281-286.

[4] 孟宏.電針對慢性應激疲勞證候模型大鼠神經(jīng)免疫網(wǎng)絡調(diào)節(jié)機制研究[D].中國優(yōu)秀博碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫(博士),2003.

[5] 王海軍,冀來喜.關于大鼠“神闕”穴的定位[J].針刺研究,2007, 32(5):312.

[6] 高峰.胃腸生物學屏障的分子生態(tài)學研究進展[J].陰山學刊(自然科學版),2006,20(1):72-74.

[7] 嚴梅楨,宋紅月,謝念祥,等.衰老動物腸道菌群的變化及黃芪的拮抗作用[J].中國中藥雜志,1995,20(10):624-626.

[8] 田碧文,胡宏.阿膠,五味子,刺五加,枸杞對雙歧桿菌生長的影響[J].中國微生態(tài)學雜志,1996,8(2):11-13.

Effect of Point Shenque Gentle Moxibustion on Intestinal Flora in Chronic Fatigue Rats

-,-,.

,110032,

To investigate the effect of point Shenque gentle moxibustion on intestinal flora in chronic fatigue rats.Forty rats were randomly allocated to normal, model, ginsenoside and Shenque groups, 10 rats each. A rat model of chronic fatigue was made by dietary inadequacy and cold water swimming. The ginsenoside group received an oral gavage of a solution of ginsenoside in water and the Shenque group, point Shenque gentle moxibustion. After 21 days, the number of typical fecal bacterial florae was determined using selective media for anaerobic and aerobic bacteria in different groups of rats.The number of bacterial florae decreased significantly in the model group compared with the normal group (＜0.05). It increased significantly in the Shenque and ginsenoside groups compared with the model group (both＜0.05). There was no statistically significant difference in the number of bacterial florae between the Shenque or ginsenoside group and the normal group (＞0.05).Point Shenque gentle moxibustion can relieve rat diarrhea and redress intestinal flora imbalance.

Moxibustion; Point, Shenque; Chronic fatigue syndrome; Intestinal flora; Rats; Moxa-stick moxibustion

1005-0957(2013)01-0056-03

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2013.01.056

2012-10-06

遼寧省博士啟動基金(20081038);高等學校博士學科點專項科研基金新教師類資助課題(20122133120001)

成澤東(1974 - ),女,教授,博士,碩士生導師

陳以國(1957 - )男,教授,博士,博士生導師,E-mail:chenyi guo@tom.com