林宇靜，郭瑞珍

(1.遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)病理教研室，2.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院病理科;廣東珠海 519041)

皮膚瘢痕癌，是皮膚病理性瘢痕被覆上皮發(fā)生癌變而形成的一種惡性腫瘤，組織學(xué)類型多為鱗狀細(xì)胞癌。針對腫瘤是一類細(xì)胞周期性疾病［1］，在細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中CDKs蛋白激酶處于中心地位，在G1期和G1/S期轉(zhuǎn)化期，CDK4和CDK6是主要的細(xì)胞周期調(diào)控子的理論。針對目前國內(nèi)對瘢痕癌的相關(guān)性研究較少，以及目前這兩種細(xì)胞因子在瘢痕癌中的表達(dá)情況及其與瘢痕癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性未見有報(bào)道的現(xiàn)狀。我們采用免疫組化法檢測正常皮膚表皮、皮膚病理性瘢痕被覆上皮和瘢痕癌組織中CDK4、CDK6蛋白，探討兩種蛋白與瘢痕癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 標(biāo)本取自遵義醫(yī)學(xué)院病理教研室和中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院病理科2005～2011年石蠟包埋的標(biāo)本，經(jīng)病理檢查證實(shí)為瘢痕癌、皮膚病理性瘢痕和正常皮膚組織3組，每組15例。

1.1.2 試劑 CDK4、CDK6單克隆抗體及SP試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2 方法 采用免疫組織化學(xué)(S－P)法 。主要步驟參照說明書進(jìn)行，DAB顯色。

1.3 結(jié)果判定 CDK4、CDK6陽性表達(dá)信號呈棕黃色，顆粒狀，陽性信號位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞質(zhì)為主。采用半定量積分法判斷結(jié)果，按照陽性細(xì)胞所占百分比與著色強(qiáng)度進(jìn)行評分:①根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比評分:陽性細(xì)胞數(shù)≤5% 為0分，6% ～25%為1分，26% ～50% 為2分，51% ～75% 為3分，＞75%則為4分。②根據(jù)著色強(qiáng)度進(jìn)行評分:無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。?、佗陧?xiàng)評分的乘積作為染色結(jié)果的評判標(biāo)準(zhǔn):0分為陰性(一)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)表達(dá)。用圖像分析系統(tǒng)檢測陽性染色的表達(dá)水平(陽性面積)和表達(dá)強(qiáng)度(光密度)。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 統(tǒng)計(jì)采用SPSS 13.0for windows統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD)，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對結(jié)果進(jìn)行Kruskal－Wallis檢驗(yàn)和相關(guān)分析，以P﹤0.01為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDK4蛋白在各組中的表達(dá) CDK4蛋白在皮膚瘢痕癌組中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，在皮膚病理性瘢痕組中呈弱陽性表達(dá)，在正常皮膚組中呈陰性或弱陽性表達(dá)，瘢痕癌組與正常皮膚組及皮膚病理性瘢痕組比較有顯著性差異(P＜0.01)(見圖1，表1)。

圖1 CDK4蛋白在不同皮膚組織中的表達(dá)(IHC×400)

表1 CDK4蛋白在各組的表達(dá)(n=15)

2.2 CDK6蛋白在各組中的表達(dá) CDK6蛋白在皮膚瘢痕癌組中呈強(qiáng)陽性表達(dá)，在皮膚病理性瘢痕組中呈弱陽性表達(dá)，在正常皮膚組中呈陰性或弱陽性表達(dá)，瘢痕癌組與正常皮膚組及皮膚瘢痕組比較有顯著性差異(P＜0.01)(見圖2，表2)。

圖2 CDK6蛋白在不同皮膚組織中的表達(dá)(IHC×400)

表2 CDK6蛋白在各組的表達(dá)(n=15)

3 討論

腫瘤是在環(huán)境因素和遺傳因素共同作用下，引起多種癌基因和抑癌基因的失衡，最終細(xì)胞周期發(fā)生紊亂、細(xì)胞失控性生長所致的一類疾病，因此認(rèn)為腫瘤是一類細(xì)胞周期性疾病。細(xì)胞周期中有一個(gè)G1－S期檢查點(diǎn)，這一檢查點(diǎn)是由Rb－E2F途徑所介導(dǎo)的，并受到依賴cyclinD1的CDK4、CDK6和依賴cyclinE的CDK2蛋白的共同調(diào)控［2］。所以在G1期和G1/S期轉(zhuǎn)化期，CDK2、CDK4和CDK6是主要的細(xì)胞周期調(diào)控子。CDK4蛋白是CDKs蛋白家族中的核心成員，其含量及活化程度在細(xì)胞增殖周期由G1期向S過渡過程中起限速作用［3～5］。在對小鼠的實(shí)驗(yàn)研究中證明，CDK4缺失的小鼠其腫瘤的發(fā)生率減少，在人體腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，前列腺癌中CDK4有明顯的擴(kuò)增和異常表達(dá)［6］，在膀胱移行細(xì)胞癌、鼻咽癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌、惡性淋巴瘤、脂肪肉瘤、黑色素瘤等腫瘤中有CDK4的過表達(dá)，表明CDK4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中起了重要作用，與腫瘤侵襲與預(yù)后有關(guān)。另有研究表明CDK6參與多種腫瘤細(xì)胞的分化［7］，在前列腺癌、骨髓瘤、肝癌、卵巢癌、黑色素瘤、Kaposi肉瘤等腫瘤中有過表達(dá)，表明CDK6參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。姜可偉等研究發(fā)現(xiàn)胃癌組織中存在CDK6的過表達(dá)，CDK6的過表達(dá)與胃癌的組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和預(yù)后有關(guān)。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)cyclinD1和CDK4的高表達(dá)與淋巴管轉(zhuǎn)移和浸潤的深度有相關(guān)性［8］，在某些淋巴瘤中有 CDK6的過表達(dá)也有CDK4的突變。以上研究提示CDK6與CDK4之間可能存在著某種相關(guān)性，在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著協(xié)同作用。CDKs多年來主要作為一個(gè)治療干預(yù)的靶點(diǎn)?？拱┥锘钚噪氖刮赴┙M織中的CDK4蛋白表達(dá)明顯低于對照組(P﹤0.01)，表明癌生物活性肽抑制腫瘤細(xì)胞生長，與CDK4表達(dá)低相關(guān)，其抗腫瘤機(jī)制可能通過下調(diào)CDK4和上調(diào)CDK2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)［10］，提示CDK4有可能作為很好的治療癌癥的靶點(diǎn)。多因素分析的結(jié)果顯示，CDK6蛋白水平是患者預(yù)后的獨(dú)立相關(guān)因素，提示CDK6有可能成為預(yù)測腫瘤預(yù)后的指標(biāo)和輔助治療的新靶點(diǎn)。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)CDK6缺失并不影響正常細(xì)胞增殖，提示CDK6可以作為很好的治療癌癥的靶點(diǎn)。

研究結(jié)果顯示，在正常皮膚表皮、皮膚病理性瘢痕上皮和瘢痕癌組織中，CDK4、CDK6蛋白的陽性表達(dá)呈上升趨勢。瘢痕癌組中CDK4、CDK6陽性表達(dá)均顯著高于正常皮膚組及皮膚病理性瘢痕組(P﹤0.01)。這提示兩個(gè)可能，與正常皮膚組和病理性瘢痕組比較，CDK4、CDK6在瘢痕癌組織中的高表達(dá)，與瘢痕癌的發(fā)生發(fā)展有相關(guān)性;與正常皮膚組比較，CDK4、CDK6在瘢痕組表達(dá)上調(diào)，提示在病理性瘢痕上皮的增生修復(fù)過程中發(fā)揮了作用。我們注意到，CDK4、CDK6在瘢痕癌組中表達(dá)大多數(shù)為中度陽性－強(qiáng)陽性，而在正常皮膚組中表達(dá)僅限于上皮的基底細(xì)胞且陽性細(xì)胞數(shù)﹤10%，CDK4在皮膚病理性瘢痕組中有6例表達(dá)，其中4例僅限于上皮的基底細(xì)胞且陽性細(xì)胞數(shù)﹤10%(即為弱陽性)，另外2例全層上皮細(xì)胞著色淺(即為中度陽性)，CDK6在皮膚瘢痕組中有5例表達(dá)，但僅限于上皮的基底細(xì)胞且陽性細(xì)胞數(shù)＜10%(即為弱陽性)，顯示上皮細(xì)胞經(jīng)歷周期的轉(zhuǎn)換。在正常皮膚組中少數(shù)基底細(xì)胞CDK4、CDK6弱陽性表達(dá)，顯示部分基底細(xì)胞增生活躍，在皮膚瘢痕組中CDK4、CDK6陽性率稍有增高且與皮膚瘢痕癌組陽性表達(dá)有顯著差異(P＜0.01)，表明細(xì)胞周期正性調(diào)控因子CDK4、CDK6蛋白高表達(dá)所致的G1期調(diào)控異常涉及了皮膚瘢痕癌的發(fā)生、發(fā)展過程。在皮膚瘢痕和瘢痕癌組中檢測CDK4、CDK6蛋白，可作為臨床早期診斷和科學(xué)評價(jià)腫瘤預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療的指標(biāo)。此外，通過反義核酸技術(shù)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上阻斷異常增殖細(xì)胞中CDK4、CDK6的異常表達(dá)，引起細(xì)胞的表型逆轉(zhuǎn)或凋亡，二者將可能為瘢痕癌基因治療研究提供新途徑。

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