袁俊杰，呂延成

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)，廣東珠海 519041)

生殖器皰疹(Genital herpes，GH)是一種易復(fù)發(fā)、難治愈的性傳播疾病，Ⅱ型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus type 2，HSV-2)是GH的主要病原體。目前，對HSV-2感染，主要使用阿昔洛韋和無環(huán)鳥苷等廣譜抗病毒藥物，這種控制無特異性，且病毒抗藥性有逐漸增加的趨勢，治療效果并不理想［1－2］。相關(guān)研究表明，RNAi技術(shù)在許多疾病的治療，尤其是對病毒感染性疾病的治療有著巨大的應(yīng)用前景，在抗艾滋病病毒、肝炎病毒、SARS病毒、流感病毒等方面，都取得了重要進(jìn)展［3］。

ICP4蛋白是病毒DNA編碼的175KD的磷蛋白，在病毒感染期間，以同形二聚體的形式存在于感染的細(xì)胞的細(xì)胞核中。它是α基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)產(chǎn)物中最重要的調(diào)節(jié)蛋白，病毒DNA通過ICP4決定轉(zhuǎn)錄體的激活，為基因表達(dá)所必須。表達(dá)載體能在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)、穩(wěn)定的產(chǎn)生RNAi作用。因此，我們針對HSV-2的ICP4基因設(shè)計(jì)RNAi的表達(dá)質(zhì)粒，觀察其對病毒ICP4的基因表達(dá)及病毒滴度的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 HSV-2 333標(biāo)準(zhǔn)株來源于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)，HEK293細(xì)胞由本校中心實(shí)驗(yàn)室提供，質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，大腸桿菌E.coli DH5α由本校中心實(shí)驗(yàn)室提供，DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自GIBCO公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自Invitrogen公司，T4 DNA連接酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自杭州碧云天生物技術(shù)研究所，限制性內(nèi)切酶Bbs I、BamH I和Pst I購自寶生物工程(中國大連)有限公司，SYBR Green PCR Master Mix購自TOYOBO公司，總RNA抽提試劑盒購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，鼠抗HSV-2 ICP4單抗購自美國US Biological，PCR引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(0.5 μmol/μL)。引物序列如下:

GAPDH，上游引物 5＇－ AGAAGGCTGGGGCTCATTTG －3＇;下游引物 5＇－ AGGGGCCATCCACAGTCTTC －3＇。ICP4，上游引物 5＇－ GGGCAACTGGACCGGC －3;下游引物5＇－AGCAGCCCCAGGAACTCC －3＇。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 針對ICP4基因shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建從GenBank上獲得HSV-2(NC_001798)ICP4基因序列，利用相關(guān)軟件設(shè)計(jì)篩選終出1條特異性序列作為靶序列 GGAGATGAAGGAGCTGCTGTT，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)不針對任何基因的序列為陰性對照(NC)GTATGACAACAGCCTCAAG。在其兩端加上Bbs I和 BamH I酶切位點(diǎn)，Loop結(jié)構(gòu)選用TTCAAGAGA序列，轉(zhuǎn)錄終止序列采用TTTTTT結(jié)構(gòu)。正義鏈模板的5＇端添加 CACC序列，與Bbs I酶切后形成粘性末端互補(bǔ);反義鏈模板的5＇端添加 GATC序列，與BamH I酶切后形成的粘性末端互補(bǔ)。

寡核苷酸鏈由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，TE(pH8.0)溶解(400 μmol/L)，取 5 μL 混勻，加入5 μL退火緩沖液，在 PCR儀上進(jìn)行退火，95℃ 5 min，85℃5 min，75℃ 5 min，70℃5 min，4℃保存。退火形成shRNA雙鏈模板，TE稀釋(20 nmol/L)。用BamH I和Bbs I限制性內(nèi)切酶將環(huán)形的pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒線性化，TE稀釋(50 ng/μL)。在離心管中加入1 μL線性化的質(zhì)粒，1 μL shRNA 模板，1 μL 10 × T4 連接緩沖液，1 μL T4 DNA 連接酶(5 U/μL)，ddH2O 加至 20 μL，室溫下連接反應(yīng)2 h，形成質(zhì)粒表達(dá)載體pGPU6/GFP/Neo－shRNA。重組載體熱激法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行BamH I和PstI雙酶切，產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果(見圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒的PstⅠ和BamHⅠ酶切鑒定

M為 DNA Mark，1－4為 shRNA ICP4載體、shRNA ICP4載體、shRNA NC載體、shRNA NC載體的Pst I酶切結(jié)果;5－9為 shRNA ICP4載體、shRNA ICP4載體、shRNA NC載體、shRNA NC載體的BamH I酶切結(jié)果。結(jié)果表明重組質(zhì)粒不能被Pst I酶切，能被BamH I切開變?yōu)榫€性化DNA，載體構(gòu)建成功。

1.2.2 HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)及表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞用DMEM完全培養(yǎng)液(10%胎牛血清，100U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素)常規(guī)培養(yǎng)，接種4×104～5×104個(gè)細(xì)胞至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)組:空白組(只加轉(zhuǎn)染試劑)、陰性對照組(shRNA NC)、干擾組(shRNA ICP4)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞融合至70%左右，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，空白組只加轉(zhuǎn)染試劑(2 μL)，陰性組加2 μg shRNA NC 載體，干擾組加 2 μg shRNA ICP4載體。

分別于12 h、24 h、36 h、48 h 在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率=熒光細(xì)胞數(shù)量/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.3 HSV-2感染HEK293細(xì)胞 ①HSV-2病毒滴度測定:HSV-2接種HEK 293細(xì)胞，加病毒維持液(98%DMEM，2%胎牛血清，100 U/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素)培養(yǎng)，90%細(xì)胞出現(xiàn)病變后，反復(fù)凍融法獲得子代病毒。終點(diǎn)滴定法測定病毒滴度，用無血清無抗生素的DMEM培養(yǎng)液對病毒上清液做10×倍比稀釋(10－1～10－8)，接種細(xì)胞，每孔100 μL病毒懸液。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h后，吸棄培養(yǎng)基，加入病毒維持液500 μL繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，CPE的記錄方法為:“+”為1% ～25%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE，“++”為26% ～50%的細(xì)胞出現(xiàn) CPE，“+++”為51% ～75%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE，“++++”為76%～100%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE。按Reed－Muench法計(jì)算，能引起50%細(xì)胞發(fā)生病變的病毒最高稀釋度TCID50，即病毒滴度。②HSV-2感染HEK293細(xì)胞空白組、陰性組、干擾組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，培養(yǎng)48 h后，接種 TCID50病毒(100 μL/孔)。37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后，吸棄培養(yǎng)基，加入病毒維持液500 μL繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白。

1.2.4 終點(diǎn)滴定法檢測轉(zhuǎn)染后的病毒滴度 空白組、陰性組、干擾組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，培養(yǎng)48h。采用上述終點(diǎn)滴定法對病毒滴度進(jìn)行測定，計(jì)算3個(gè)組相應(yīng)的TCID50。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR檢測ICP4基因mRNA的表達(dá) ①細(xì)胞總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄用:RNAisoTMPlus提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA的純度及濃度。在RNase free的PCR管中，加2 μL 總 RNA 與 10 μL 無 RNase的 H2O，混勻，85℃保溫5 min，使RNA變性，立即冰上致冷，防止復(fù)性。在該P(yáng)CR管中加入下列試劑:0.5 μL Oligo(dT)，0.5 μL Random primer，2μL 10 mM dNTP，0.5 μL RNase inhibitor，4 μL 5x buffer，0.5 μL M－MLV。上述20 μL反應(yīng)溶液30℃保溫10 min，42℃保溫60 min，85℃保溫10 min。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄水平:以GAPDH作內(nèi)參檢測各組細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄水平，用Real－time PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)TOYOBO公司SYBR Green PCR Master Mix試劑盒配制反應(yīng)體系:cDNA模板5 μL，上游引物、下游引物各0.5 μL，2x SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 4 μL。進(jìn)行Real－time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件:95℃5 min，預(yù)變性，95 ℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 32 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.6 Western blot檢測ICP4蛋白的表達(dá) 常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白，加上樣緩沖液混勻后，進(jìn)行SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，5%脫脂奶粉封閉后洗膜，加入一抗，洗膜后與相應(yīng)的二抗反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光法顯色，顯影，定影。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，表1數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)分析，表2數(shù)據(jù)采用檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 shRNA重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，GFP的表達(dá)達(dá)到高峰。通過普通光和熒光下，同一視野內(nèi)可激發(fā)熒光細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算得出轉(zhuǎn)染效率達(dá)50%以上。

2.2 HSV-2病毒滴度測定 終點(diǎn)滴定法測定HSV-2病毒TCID50，以確定感染細(xì)胞所需的病毒量。以 Reed－Muench法計(jì)算 TCID50，結(jié)果為10－3.6/100 μL(含義是將該病毒液稀釋10的3.6倍，接種100 μL能使50%的細(xì)胞發(fā)生病變效應(yīng))。

2.3 shRNA表達(dá)載體對HSV-2病毒活力的影響轉(zhuǎn)染shRNA后進(jìn)行病毒滴定測定，計(jì)算子代病毒的TCID50，檢測子代病毒的活力(見表1)。

表1 轉(zhuǎn)染shRNA后病毒滴度測定

2.4 shRNA表達(dá)載體對ICP4 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響采用Comparative Delta－delta相對定量法，以空白組為對照計(jì)算干擾組mRNA的表達(dá)量。用2－△△Ct表示ICP4相對GAPDH mRNA的定量，其中Ct值是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。△△Ct=(Ct目的基因－ Ct管家基因)干擾組－ (Ct目的基因－Ct管家基因)對照組。轉(zhuǎn)染 shRNA 載體后，對 ICP4 基因mRNA的抑制效率可達(dá)71%，能夠有效抑制病毒的轉(zhuǎn)錄(見表2)。

表2 shRNA表達(dá)載體對ICP4 mRNA的抑制效果

2.5 shRNA表達(dá)載體對ICP4蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測shRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，對ICP4蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ICP4蛋白表達(dá)與對照組相比有明顯下降，陰性組蛋白表達(dá)減少7.59%，實(shí)驗(yàn)組蛋白表達(dá)減少71.81%(P＜0.05)。

圖2 Western blot檢測ICP4蛋白表達(dá)的影響

3 討論

ICP4基因是HSV-2感染和復(fù)制的一個(gè)關(guān)鍵基因，病毒通過ICP4決定轉(zhuǎn)錄體的激活［4］，該基因的表達(dá)降低可抑制病毒的復(fù)制，降低病毒活性，故ICP4基因的特異siRNA干擾的考慮位點(diǎn)。本研究也表明，shRNA重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可以抑制ICP4的基因表達(dá)，降低病毒的活性和增殖。

RNAi作為一種新型基因阻斷技術(shù)，在病毒治療方面有著巨大的應(yīng)用前景［5］，質(zhì)粒載體能在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)、穩(wěn)定的產(chǎn)生 siRNA，發(fā)生 RNAi的作用［6］。目前，國內(nèi)外尚無利用shRNA表達(dá)載體干擾ICP4基因表達(dá)，來抑制HSV-2復(fù)制的相關(guān)報(bào)道。所以，本實(shí)驗(yàn)采用通過pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒載體制備siRNA的方法進(jìn)行RNA干擾。

通過比較空白組、陰性組以及實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞CPE，觀察shRNA表達(dá)載體對HSV-2的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組細(xì)胞均不同程度的出現(xiàn)CPE，轉(zhuǎn)入shRNA ICP4的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞CPE最弱。說明重組載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，抑制了病毒的感染和復(fù)制。用終點(diǎn)滴定法測定細(xì)胞上清液中子代病毒滴度，觀察shRNA表達(dá)載體對子代病毒活力的影響。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液子代病毒滴度明顯下降，說明重組載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后，抑制了子代病毒的活力。實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR和Western blot的結(jié)果顯示，mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的下降趨勢同步，表明重組載體在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可以有效抑制ICP4的基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明，通過RNAi阻斷ICP4基因的表達(dá)可以有效的抑制HSV-2的復(fù)制。

RNAi技術(shù)的發(fā)展為HSV-2的治療提供新的思路，但實(shí)際應(yīng)用中仍然存在許多問題:RNAi不能達(dá)到百分百的抑制，可能需要其他方法輔助作用;如何安全有效的將RNAi導(dǎo)入人體，避免脫靶甚至“誤傷”的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)研究了細(xì)胞內(nèi)shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體產(chǎn)生的siRNA對HSV-2的抑制效應(yīng)，在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段表明了RNAi在HSV-2防治工作中的高效特異性，為進(jìn)一步研究針對HSV-2的有效RNAi治療方法打下基礎(chǔ)。

［1］Looker K J，Gamett G P，Schmid G P.An estimate of the global prevalence and incidence of herpes simplex vires type 2 infection［J］.Bulletin of WHO，2008，86:805 －812.

［2］Zhu J，Hladik F，Woodward A，et al.Persistence of HIV －1 receptor－positive cells after HSV-2 reactivation is a potential mechanism for increased HIV －1 acquisition［J］.Nature Medicine，2009，15(8):886 －892.

［3］Alexander Karlas，Nikolaus Machuy，Yujin Shin，et al.Genome－wide RNAi screen identifies human host factors crucial for influenza virus replication［J］.Nature，2010，463:818－822.

［4］James W.Bruce，Kent W.Wilcox.Identification of a Motif in the C Terminus of Herpes Simplex Virus Regulatory Protein ICP4 That Contributes to Activation of Transcription［J］.J Virol，2002，76(1):195 －207.

［5］Ishaq Musarat，Hu Jiajie，Wu Xiaoyun，et al.Knockdown of Cellular RNA Helicase DDX3 by Short Hairpin RNAs Suppresses HIV－1 Viral Replication Without Inducing Apoptosis［J］.Molecular Biotechnology，2008，39(3):231－238.

［6］Cheng Zhigang，Mo Qiuhua，Li Jingyip，et al.RNAT － U6.1/Neo－mediated plasmid expressing DREAM shRNA and silencing DREAM in C6 cell lines［J］.China journal of modern medicine，2011，21(10):1129 －1134.