周竹超龔軼一倪泉興

1.復旦大學附屬華山醫(yī)院普外科，上海200040；

2.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院胰腺外科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海200032

胰腺腫瘤干細胞研究新進展

周竹超1龔軼一1倪泉興2

1.復旦大學附屬華山醫(yī)院普外科，上海200040；

2.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院胰腺外科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海200032

胰腺腫瘤尤其是胰腺導管腺癌的惡性程度高，轉(zhuǎn)移性強，預后差。以往研究表明腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSC)在胰腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，深入了解胰腺腫瘤的發(fā)病機制將有助于針對性治療。在胰腺發(fā)育過程中，復雜的信號通路和轉(zhuǎn)錄因子決定了其前體細胞分化方向，在胰腺發(fā)生惡變過程中，這些因素又參與其中，因而往往可以作為追溯CSC的標志。一些研究也應用特定蛋白來篩選胰腺CSC?，F(xiàn)就胰腺CSC的來源、鑒定和靶向治療進行綜述。

胰腺癌；干細胞；腫瘤干細胞；信號通路；靶向治療

臨床上胰腺惡性腫瘤主要為胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)，其惡性程度高，早期診斷困難，易局部浸潤和全身轉(zhuǎn)移，在美國和日本分別位居癌癥死亡的第4位［1］和第5位［2］。迄今，PDAC的手術切除率僅20%，由于對常規(guī)化療和放療不敏感，易復發(fā)和轉(zhuǎn)移，術后的5年生存率僅20%～25%［3-4］。所以研究胰腺腫瘤細胞起源、癌變機制和轉(zhuǎn)化過程具有很重要的臨床意義。近年來，對于胰腺腫瘤來源于腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSC)的假說日益受到關注，其理論核心是胰腺腫瘤中存在很小一部分具有自我更新和多向分化能力的CSC，異常增殖分化形成腫瘤。由于CSC具有干細胞特性，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和治療后復發(fā)中起決定性作用，所以對胰腺CSC的分離和鑒定、微環(huán)境和信號通路的調(diào)控作用以及耐藥性和轉(zhuǎn)移機制的研究，可為胰腺腫瘤特異性靶向治療提供突破性的結(jié)果。

1 胰腺發(fā)育的信號調(diào)控和胰腺干細胞

胰腺具有外分泌和內(nèi)分泌兩種功能：前者指由腺泡細胞與連接腺泡和導管間的泡心細胞(centroacinar cells, CAC)分泌消化酶和水電解質(zhì)，經(jīng)過導管細胞組成的導管進入腸道幫助消化；后者主要是由分泌胰高血糖素、胰島素、生長抑素、胰多肽的胰島α、β、δ、PP細胞組成。

胰腺起源于內(nèi)胚層，研究發(fā)現(xiàn)，與胰腺相關最早的胚胎學變化為間充質(zhì)聚集在內(nèi)胚層原腸腔十二指腸原基處背側(cè)。小鼠胚胎第9.5天(人類妊娠第26天)時，內(nèi)胚層外翻進入疊加的間充質(zhì)內(nèi)并逐漸外突形成背側(cè)胰芽。大約12 h(人類為第6天)后，肝膽原基的尾側(cè)外翻形成腹側(cè)胰芽。在小鼠胚胎第12～13天(人類妊娠第37～42天)時，隨著原腸腔的旋轉(zhuǎn)和背側(cè)胰芽的延伸，背腹側(cè)胰芽慢慢融合，在十二指腸原基處形成一個環(huán)狀(C-loop)結(jié)構(gòu)，即是胰腺器官雛形。在小鼠胚胎第13～14天時，胰腺內(nèi)分泌細胞數(shù)迅速擴增，尤其是β細胞開始大量分化，并取代α細胞占胰島細胞中的大部分，相應地導致胚胎中胰島素和胰高血糖素的分泌水平發(fā)生逆轉(zhuǎn)。與此同時，胰腺導管不斷形成側(cè)支，伴隨著腺泡酶基因表達呈指數(shù)型增加，導管和腺泡在形態(tài)和功能上分化成熟［5］。

在胰腺發(fā)育成熟過程中，胰腺前體細胞受到多種信號通路的調(diào)控，確切機制復雜，尚未明了。已知的相關信號通路包括TGF-β、Notch、Sonic hedgehog(Shh)、FGF、EGF、Retinoids、Wnt、Bmi1、Pten、Hippo等。多種轉(zhuǎn)錄因子如胰十二指腸同源盒1(pancreas duodenum homeobox-1，PDX1)、Nkx2.2、Nkx6.1 and Nkx6.2、HlxB9、Ptf1a(p48)、MIST1、NeuroD(BETA2)、Neurogenin 3(Ngn3)、Isl1、Pax4、Pax6、MafA、HNF cascade、Sox9、Sox4、Myt1、GATA6和GATA4等也在胰腺的發(fā)育中起作用［6-9］。起決定作用的3個主要調(diào)節(jié)因素包括Shh信號通路的關閉、PDX1的表達增加和 Notch信號通路的調(diào)控［10］。此外，Shh、Notch和PDX1還與胰腺內(nèi)、外分泌干細胞的“干細胞”特性保持密切相關并參與腫瘤的生成。Shh編碼Hedgehog蛋白，其下游作用因子Gli直接作用于靶基因。Hedgehog信號通路調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和成體許多組織器官干細胞的自我更新與增殖。內(nèi)胚層原腸腔上皮細胞Shh信號的關閉決定了十二指腸原基處內(nèi)胚層分化成胰腺而不是相鄰的腸道。在胰芽形成和生長的過程中起主要作用的是PDX1。PDX1是由Hox-like同源結(jié)構(gòu)基因所編碼的轉(zhuǎn)錄因子，敲除PDX1的小鼠胚胎無法發(fā)育形成一個完整的胰腺，證明它在胰腺發(fā)育中至關重要［11］。由于其功能較多，也被稱為胰島素啟動因子1(insulin promoter factor-1，IPF1)、生長抑素轉(zhuǎn)錄激活因子1(somatostatin transactivating factor-1，STF1)、胰島素下游因子(insulin upstream factor-1，IFU1)、葡萄糖敏感因子(glucose-sensitive factor)等。在成體胰腺中它主要在內(nèi)分泌細胞中表達，對胰島素、生長抑素、胰淀粉酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運子-2和葡萄糖激酶的表達起重要作用［12］。隨著胰腺發(fā)育，Notch信號處于正常水平時，胰腺祖細胞表達Hes-1(hairy and enhancer of split Ⅰ)和p48向外分泌方向分化；與之相反，抑制Notch信號通路導致Ngn3表達增強，使胰腺祖細胞向內(nèi)分泌方向分化［13］(圖1)［14］。

De Back等［15］研究認為，在早期胰腺發(fā)育過程中細胞間側(cè)向穩(wěn)定(lateral stabilization)耦合側(cè)向抑制(lateral inhibition)作用決定了其內(nèi)分泌和外分泌細胞的發(fā)育方向，這對Notch信號通路單純通過側(cè)向抑制來控制胰腺多能細胞發(fā)展方向的理論作了補充。Notch信號通路中的Notch受體分為4個亞型，分別為Notch1、Notch2、Notch3、Notch4。Lammert等［16］在小鼠胚胎發(fā)育過程中進行原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)，在胰腺胚胎發(fā)育過程中Notch1最先開始表達，當Hes-1同時表達時提示Notch1通路被激活，隨后Notch2表達在導管，Notch3、Notch4則表達在胰腺間充質(zhì)和內(nèi)皮細胞中。Murtaugh等［17］在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，在PDX1陽性的胰腺前體細胞中異位活化表達Notch可使其向內(nèi)分泌和外分泌的分化同時停止，并停留在祖細胞階段，這說明Notch信號通路在胰腺早期發(fā)育中起著維持胰腺上皮祖細胞處于未分化狀態(tài)，直至分化條件成熟的作用。

胰腺正常干細胞(normal stem cell，NSC)的研究是胰腺疾病替代治療的重點，和胰腺CSC的研究相輔相成，盡管近年來已經(jīng)取得了一定的進展，但仍缺乏可靠的標志物及可信的評價系統(tǒng)。目前胰腺NSC較公認的特異性標志物有PDX1、Ngn3、巢素蛋白(nestin)、Notch信號、細胞角蛋白(cytokeratin，CK)、MSH2、β-半乳糖苷酶、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)等［18］。

圖 1 胰腺發(fā)育中的主要影響因子［14］Fig. 1 Key factors involved in pancreas development: Shh, Pdx1 and Notch signal pathway[14]

2 胰腺CSC的來源

胰腺腫瘤起始于胰腺CSC［19］。PDAC的癌前期病變可以分為胰腺上皮內(nèi)瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)、導管內(nèi)乳頭狀黏液瘤(intraductal papillary mucinous neoplasia，IPMN)和黏液囊性瘤(mucinous cystic neoplasia，MCN)，其中PanIN 最為常見。Hruban等［20］和Stanger等［21］認為，PanIN起源于連接胰腺腺泡和導管的CAC，并且在CAC增生與PanIN之間存在一個腺泡-導管化生(acinar-ductal metaplasia, ADM)過程。De La等［22］研究證實ADM是胰腺腫瘤形成的第一步，且ADM過程需要Notch和K-ras的協(xié)同作用來完成。Lee等［23］報道，nestin是外分泌胰腺干細胞的標志之一，而nestin陽性細胞表達Notch2，此類胰腺干細胞可以轉(zhuǎn)型分化為導管細胞。Mazur等［24］發(fā)現(xiàn)，選擇性阻斷Notch2能使PanIN進程停止，而阻斷Notch1則無效，這說明Notch2是調(diào)控PanIN發(fā)展及向PDAC演變的關鍵信號。Miyamoto等［25］發(fā)現(xiàn)CAC中Notch信號持續(xù)活化，Notch信號的靶基因Hes-1是已知的CAC標志，結(jié)合其在胰腺中的特殊位置，推斷CAC可能為胰腺干細胞或胰腺癌起始細胞。

Rovira等［26］用醛脫氫酶(aldehydedehydrogenase，ALDH)為標志分離了一部分泡心細胞和終末導管細胞，發(fā)現(xiàn)這群細胞能高表達胰腺發(fā)育過程中一些基因，能形成自我更新的細胞球體，并可分化成內(nèi)分泌和外分泌胚胎細胞。不僅如此，當胰腺上皮受到慢性損傷時，此群細胞驟然增殖，顯示其對胰腺上皮的修復再生能力。此外，選擇性敲除PTEN，一種磷脂酸肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3-K)信號的負調(diào)控因子，會引起泡心細胞數(shù)量的激增，在ADM過程中直接取代腺泡細胞并分化成導管，并可導致胰腺導管的惡變［27］。上述發(fā)現(xiàn)均提示泡心細胞可能是胰腺腺泡和導管的干細胞，很可能為PDAC的細胞來源。近來也有研究認為表達LGR5和Nanog的胰腺β細胞可能是胰腺癌干細胞的來源［28］，但具體需要更多實驗去證明。

3 胰腺CSC的分離和鑒定

胰腺和乳腺同為腺體器官，有著相似的組織結(jié)構(gòu)，因此篩選胰腺癌干細胞的表面標志時借鑒了已被公認的乳腺癌干細胞標志物CD44+CD24lowESA+［29］。Li等［30］就以這3種標志不同組合對人胰腺癌小鼠移植瘤細胞用流式方法進行分類篩選，再將篩選出的細胞接種到NOD/SCID小鼠。結(jié)果顯示，在胰腺癌細胞中僅占0.2%～0.8%的CD44+CD24+ESA+細胞具有明顯的腫瘤形成能力，由此類細胞分化增殖形成的異質(zhì)性腫瘤與直接從患者體內(nèi)取得的腫瘤組織在病理形態(tài)、胰腺癌分化標志物S100P和分層蛋白(stratifin)的表達類型上均非常相近。不僅如此，此類細胞還高表達與胰腺癌早期發(fā)生相關的信號Shh，并可在懸浮培養(yǎng)中聚集形成細胞球體(sphere)，顯示其自我更新能力。但也有學者對此項研究提出質(zhì)疑：①ESA是上皮細胞的標志，因此把ESA-細胞(主要是非上皮的炎性、間質(zhì)和血管細胞)作為對照顯然有局限性［31］。②細胞周期分析顯示CD44+CD24+ESA+和CD44-CD24-ESA-兩群細胞沒有明顯區(qū)別，這不符合干細胞應該處于靜止期的常規(guī)，提示前者研究中的子代細胞可能并非來自推定的CSC，而僅是發(fā)生了表型標志的改變。③CD44+CD24+ESA+細胞高表達Shh可能由于分選導致的富集，要證實干細胞通路Shh活化的直接靶標應該是定量PCR檢測其作用因子Gli。④研究中未給出有力的CSC按等級體系(hierarchy)分化的依據(jù)，子代腫瘤表達了分化標志S100P和stratifin如同原代腫瘤一樣僅顯示了腫瘤分化的狀態(tài)，無法區(qū)分腫瘤的異質(zhì)性來源于克隆演變還是CSC。單個CSC能按等級體系分化成腫瘤的不同組分才是最根本的證明［32］。

Hermann等［33］發(fā)現(xiàn)，占胰腺癌組織細胞總數(shù)1%～3%的CD133+細胞具有顯著的腫瘤起始能力。此外，胰腺癌L3.6pl 細胞系中CD133+細胞同樣有很強的致瘤性，能在無血清懸浮培養(yǎng)下形成可擴增的球體細胞。值得注意的是，綜合檢測結(jié)果顯示標志為CD44+CD24+ESA+和CD133+的兩組胰腺癌細胞重疊率僅14%，究竟是這兩群細胞代表了不同的胰腺癌干樣細胞抑或具有以上4種標志的胰腺癌細胞具有更強的CSC特性有待進一步研究。然而更多的報道對CD133+作為胰腺癌CSC的標志提出異議：①CD133抗原可被糖基化修飾，在胰腺癌研究中不同小組采用不同的CD133抗體可引出相反的實驗結(jié)論［34-35］。還有研究發(fā)現(xiàn)不論干樣細胞還是分化細胞，CD133在結(jié)腸上皮普遍表達，提出CD133不適宜作為消化道CSC的標志物［36-37］。②在神經(jīng)細胞CSC的鑒定中，CD133+球體細胞展示了分化成多種譜系細胞的能力，CD133+胰腺癌球體細胞在分化條件下可擴增，但未給出明確的多向分化的依據(jù)［32,38］。③直接以NSC標志物CD133或CD44、CD24作為假定的CSC標志物進行鑒定使得研究對象從開始就受到了限制。這種局限性存在于多種腫瘤的CSC研究中。理想的表面標志物本身應該和CSC自我更新的功能相關，受到自我更新相關基因的調(diào)控。

最近，有研究認為ALDH能作為胰腺CSC的內(nèi)源性標志。ALDH是一種內(nèi)生性的酶，在乙醇和視黃醛的代謝中起關鍵作用，為正常胰腺發(fā)育所必需且和胰腺癌的發(fā)生有關。研究顯示腫瘤組織標本中陽性表達ALDH的胰腺癌患者預后較差。ALDH+胰腺癌細胞較ALDH-細胞具有更強的致瘤性、克隆形成能力和轉(zhuǎn)移侵襲能力。ALDH+和CD44+CD24+兩群細胞幾乎沒有重疊(CD44+CD24+ALDH+細胞比例＜0.1%)，而體外實驗中前者似乎比后者更具侵襲力［39］。但在更全面的檢測中發(fā)現(xiàn)ALDH在胰腺腫瘤組織和正常胰腺組織中均有廣泛表達，因此也不適宜作為胰腺CSC的標志物［40］。

經(jīng)過長期體外傳代培養(yǎng)的胰腺癌細胞系遺傳物質(zhì)可能存在未知的改變，作為CSC的研究材料可信度固然不如原代腫瘤組織，但穩(wěn)定性和一致性卻是其優(yōu)點。Olempska等［41］以干細胞標志物ABCG2和CD133為標志測定了5種胰腺癌細胞株(Panc1、Panc89、Colo357、PancTul和A818-6)中的胰腺癌干細胞。推測標志物ABCG2和CD133陽性細胞可能為胰腺癌干細胞。Gou等［42］將胰腺癌Panc1細胞培養(yǎng)在無血清條件下并添加生長因子等誘導球體形成，此類球體細胞能排斥熒光染料Hoechst，且在體外和體內(nèi)實驗中均較常規(guī)培養(yǎng)下的Panc1細胞有更強的增殖能力，提出Panc1球體細胞有干細胞特性。但無血清培養(yǎng)下的細胞更具致瘤性是否與培養(yǎng)液中添加了促進有絲分裂的生長因子bFGF和EGF有關，還有待說明。Zhou等［43］檢測到Panc1細胞中側(cè)群細胞(side-population cell，SP)的比例為3.3%，經(jīng)吉西他濱(Gemcitabine)培養(yǎng)后比例上升至9.8%，此群細胞較非SP細胞高表達ABCB1和ABCG2，可能是其排斥Hoechst和耐藥性的原因。以往的研究證明SP細胞為卵巢CSC［44］，但是胰腺腫瘤SP是否就是CSC還需要更多的實驗數(shù)據(jù)證明。由于胰腺腫瘤發(fā)生機制較復雜和CSC含量較低，現(xiàn)階段的一些鑒定方法均無法給出權(quán)威的證據(jù)，所以對于胰腺CSC標志物的鑒定仍是研究胰腺腫瘤的重要課題。

4 針對胰腺CSC的生物學治療

開發(fā)選擇性靶向胰腺CSC的治療方法必須首先解決一個長期困擾研究者的問題，如何避免對NSC產(chǎn)生不良反應，因為這兩者有太多共性，甚至有研究者認為它們的差異只是所處的微環(huán)境造成的［45］。盡管如此，近幾年在針對胰腺CSC的治療上仍取得了一定的突破。Muller等［46］在體外和體內(nèi)實驗中均證明將干細胞相關信號通路Shh的抑制劑環(huán)杷明(cyclopamine)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的阻斷劑雷帕霉素(rapamycin)和吉西他濱聯(lián)合應用可有效殺滅胰腺CSC，進而縮小腫瘤，抑制轉(zhuǎn)移，延長無瘤生存期，而單一應用其中一種藥物則無此效果，稱為CRG方案。mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于PI3K家族，mTOR信號通路在某些腫瘤發(fā)生過程中被不適當?shù)募せ睿虼?，mTOR信號通路的抑制劑可作為這些腫瘤患者的靶向性治療劑［47］。有研究發(fā)現(xiàn)在血液系統(tǒng)中敲除mTOR通路上游的負調(diào)控因子PTEN可使NSC衰竭，但卻同時使白血病起始細胞增多，而采用mTOR抑制劑則起到相反的作用［48］。這個結(jié)果的意義在于研究者終于可以通過抑制mTOR通路而在打擊CSC時避免損傷NSC和正常組織細胞。此外，CRG方案的3種藥物，均已分別在臨床使用，縮短了研發(fā)周期，藥代動力學和不良反應也已被掌握，期待其聯(lián)合應用能早日進入臨床。

萊菔硫烷(sulforaphane，SFN，SF，又名蘿卜硫素)，是一種主要存在于西蘭花和其他十字花科蔬菜中的異硫氰酸鹽類物質(zhì)，可預防許多化學致癌物誘導的DNA損傷和多種腫瘤的發(fā)生，是潛在的腫瘤治療藥物。Kallifatidis等［49］發(fā)現(xiàn)，將SF與化療藥物聯(lián)合應用可抑制胰腺CSC的集落生成、球體形成和ALDH活性，小鼠體內(nèi)實驗更證實了SF能增強細胞毒類藥物對胰腺CSC的效力，卻未增加化療毒性。進一步研究發(fā)現(xiàn)在SF基礎上再聯(lián)合同樣對胰腺CSC有效的多靶點抗腫瘤藥物索拉非尼(sorafenib，SO)可顯著誘發(fā)胰腺腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管增殖和上皮間變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，縮小腫瘤體積，有希望成為另一種對抗胰腺CSC的藥物組合［50］。除此以外，干細胞相關信號通路(如Shh［51］、mTOR、Pten、Notch、Bmi1、Wnt)阻斷劑、MicroRNAs(如miR-34［52］、miR-200家族［53］)、端粒酶模板拮抗劑(如GRN163L［54］)等也是胰腺CSC生物學治療的研究方向。

5 結(jié)論

迄今，雖然有多個研究組致力于胰腺CSC的分離和鑒定，并以特異性標志物如CD44、CD24、ESA、CD133、CXCR4和ALDH等分離得到了多種胰腺癌干樣細胞群，但其間少有交集，也仍缺乏作為胰腺CSC的充分證據(jù)。此外，胰腺CSC的細胞來源、組織定位、信號通路調(diào)控機制、微環(huán)境的作用、耐藥和轉(zhuǎn)移的分子生物學機制等眾多問題尚未明確。胰腺CSC的研究仍處于早期階段。提高胰腺腫瘤的5年生存率是國際上的難題，其中靶向胰腺CSC的治療可以從源頭上殺滅腫瘤細胞，根治腫瘤，是非常有前景的研究領域，但高選擇性地只針對CSC而不損傷NSC是個巨大的挑戰(zhàn)。令人振奮的是，隨著對CSC抗藥性和調(diào)控機制的不斷深入剖析，針對胰腺CSC的多種生物治療已略見療效，可能在不久的將來，隨著機制的明確和多種療法的聯(lián)合應用，對胰腺腫瘤的治療將取得突破性的進展。

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Recent progress on pancreatic cancer stem cells

ZHOU Zhu-chao1, GONG Yi-yi1, NI Quan-xing2(1.Department of General Surgery, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China; 2. Department of Pancreatic Surgery, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

NI Quan-xing E-mail: ni_quanxing@hotmail.com

Pancreatic neoplasm, especially pancreatic ductal adenocarcinoma tends to be with bad prognosis due to higher grade malignancy and metastasis. Formerly researches suggested that cancer stem cells play an important part in the initiation and process of pancreatic cancer, so that, well understanding on the mechanism of pathogenesis will contribute to a direct treatment on it. Complex signal pathways and transcription factors determined the differentiation of precursor cells during the development of pancreas, whereas, also involved in pancreatic malignant changes, which could be used as markers tracking cancer stem cells. Moreover, several special proteins were also employed as tools for pancreatic cancer stem cells screening. In this text, we reviewed origination and identification of pancreatic cancer stem cells, as well as targeted therapy.

Pancreatic carcinoma; Stem cells; Cancer stem cells; Signal pathways; Targeted therapy

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.05.011

R735.9

：A

：1007-3639(2013)05-0382-07

2013-03-10

2013-04-15）

倪泉興 E-mail:ni_quanxing@hotmail.com