張飛王瑧張萍張波楊文濤李影奕

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胰腺肝膽外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032；

3.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

異常高表達(dá)TCTP通過上調(diào)Bcl-xL抑制胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡

張飛1王瑧1張萍1張波2楊文濤3李影奕1

1.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胰腺肝膽外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032；

3.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

背景與目的：胰腺癌是一種常見的惡性腫瘤，病死率高，5年生存率＜5%，目前尚無很好的治療方法。翻譯控制腫瘤蛋白(translationally controlled tumor protein，TCTP)是一個生長相關(guān)的蛋白質(zhì)，有促進(jìn)腫瘤生長，抗細(xì)胞凋亡的作用，目前有研究顯示TCTP在肝癌、結(jié)直腸癌中異常高表達(dá)，但其在胰腺癌中的相關(guān)研究報道較少。本研究通過對TCTP在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其生物學(xué)作用機(jī)制分析，致力于尋找新的腫瘤分子靶點，為胰腺癌的靶向治療提供依據(jù)。方法：采用免疫組織化學(xué)方法檢測胰腺癌組織中TCTP表達(dá)情況；RT-PCR檢測胰腺癌細(xì)胞株中TCTP的mRNA表達(dá)，Western blot方法檢測胰腺癌細(xì)胞株中TCTP和Bcl-xL蛋白表達(dá)水平；免疫熒光染色方法檢測TCTP在胰腺癌細(xì)胞中的定位；小分子RNA干擾技術(shù)沉默胰腺癌細(xì)胞中TCTP表達(dá)后，利用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)指標(biāo)。結(jié)果：與正常胰腺組織相比，胰腺癌組織中TCTP異常高表達(dá)，并且主要位于胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中；不同胰腺癌細(xì)胞株中TCTP也呈高表達(dá)；siRNA沉默胰腺癌細(xì)胞中的TCTP，顯著抑制細(xì)胞的增殖速度和細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；在胰腺癌細(xì)胞中Bcl-xL表達(dá)與TCTP表達(dá)呈正相關(guān)，沉默TCTP可以下調(diào)Bcl-xL的蛋白表達(dá)。結(jié)論：異常高表達(dá)TCTP，通過上調(diào)Bcl-xL抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展。

翻譯控制腫瘤蛋白；胰腺癌；Bcl-xL；siRNA

胰腺癌是全球范圍內(nèi)常見惡性腫瘤，生存期短，病死率居惡性腫瘤的第4位［1］，早期胰腺癌患者主要接受手術(shù)、化學(xué)藥物及放射治療，其5年生存率約20%。晚期胰腺癌患者已經(jīng)失去了根治性手術(shù)切除的機(jī)會，中位生存期僅為 3～6個月，5年生存率＜5%［2］。因此，尋找新的調(diào)節(jié)胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵靶基因及相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制，對于胰腺癌的治療及預(yù)后評估具有重要的轉(zhuǎn)化應(yīng)用價值。

翻譯控制腫瘤蛋白(translationally controlled tumor protein，TCTP)是一個高度保守的親水性蛋白［3］，廣泛存在于真核生物包括真菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物［4］。TCTP又被稱為IgE依賴的組胺釋放因子(HRF)、fortilin、P21、P23和TPT-1［5-7］。TCTP最早發(fā)現(xiàn)于腫瘤細(xì)胞，由于其mRNA具有翻譯控制mRNA的所有序列和結(jié)構(gòu)，所以稱之為翻譯控制腫瘤蛋白［8］。TCTP基因定位于13q12—q14［9］，由5個外顯子和6個內(nèi)含子構(gòu)成，全長3 819個核苷酸，編碼172個氨基酸［10］。TCTP是一個生長相關(guān)的蛋白質(zhì)，有促進(jìn)腫瘤生長、抗細(xì)胞凋亡的作用，阻斷該蛋白表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型［11］。TCTP在肝癌、結(jié)直腸癌中異常高表達(dá)［12-13］，但其在胰腺癌中的相關(guān)研究報道較少。本研究通過對TCTP在胰腺癌中的表達(dá)及其作用分子機(jī)制解析，致力于尋找新的腫瘤分子靶點，為胰腺癌的靶向治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)CI35、PCI55、Miapaca-2、PANC-1、L3.6pL培養(yǎng)于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，BxPc-3、人胚腎HEK293細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(培養(yǎng)基和血清均購自Gibco公司)。

1.2 試劑

具體抗體試劑包括兔抗TCTP抗體(Epitomics公司)、鼠抗Bcl-xL抗體(ProteinTech公司)、羊抗兔HRP抗體、羊抗鼠HRP抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)和綠色熒光抗兔HRP抗體(Jackson ImmunoResearch公司)。PCR反應(yīng)試劑盒購自TaKaRa公司，免疫組化試劑盒GTvision DAB試劑盒購自Gene Tech公司，CCK-8試劑盒購自Dojindo公司，細(xì)胞周期和Annexin Ⅴ/PI凋亡試劑盒購自Invitrogen。LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司。

1.3 免疫組化染色

人胰腺癌組織來自復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，并且經(jīng)過患者知情同意，距離癌組織2 cm以上的胰腺組織被視為正常胰腺組織用來做陰性對照組。組織經(jīng)過脫蠟，用3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，正常羊血清常溫封閉1 h，抗TCTP抗體(1∶500)4 ℃溫育過夜，二抗(1∶100)37 ℃溫育1 h，GTvision DAB kit免疫組化試劑盒顯色。顯微鏡下觀察結(jié)果，棕色顆粒定位于細(xì)胞質(zhì)中。

1.4 逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的TCTP基因序列信息，采用Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，經(jīng)BLAST分析，由上海捷瑞公司合成。GAPDH引物為：上游5’-TGTGATGGTGGGAATGGGC -3’；下游5’-TTTGATGTCACGCACGATTTC -3’。TCTP引物為：上游5’-GGGGAAGATGGTCAGTAG-3’；下游5’-TCACGGTAGTCCAATAGAG -3’。

培養(yǎng)胰腺癌PCI35、PCI55、MiaPaca-2、BxPc-3、PANC-1、L3.6pL細(xì)胞和人胚腎HEK 293細(xì)胞，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。GAPDH循環(huán)次數(shù)為25，退火溫度為60 ℃，TCTP循環(huán)次數(shù)為30，退火溫度為58 ℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶和內(nèi)參，條帶經(jīng)紫外光顯色灰度掃描，半定量檢測胰腺癌細(xì)胞系及HEK293細(xì)胞中TCTP基因表達(dá)水平。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測

收集胰腺癌PCI35、PCI55、Miapaca-2 BxPc-3、PANC-1、L3.6pL細(xì)胞和人胚腎HEK 293細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，每個樣品上樣30 g，行蛋白電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜(美國MiLLipore公司)上，封閉后順序加一抗(1∶1 000)，二抗(1∶5 000)，進(jìn)行雜交，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國MiLLipore公司)檢測雜交信號。

1.6 免疫熒光染色

將PCI55和MiaPaca-2細(xì)胞培養(yǎng)于載玻片上，4%的多聚甲醛固定，3%羊血清封閉1 h，一抗(抗TCTP抗體1∶100)4 ℃過夜，熒光二抗(1∶100)37 ℃溫育1 h，細(xì)胞核用DAPI染色15 min，激光共聚焦(萊卡)檢測熒光信號。

1.7 siRNA干擾TCTP蛋白表達(dá)

合成TCTP小分子干擾RNA(siRNA)，TCTP siRNA序列為5’-AAGGTACCGAAAGCACAGT-3’，對照Scramble siRNA 序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。PCI55和MiaPaca-2細(xì)胞傳代第2天用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)按照說明書要求，將TCTP siRNA和 Scramble siRNA分別轉(zhuǎn)入PCI55細(xì)胞中。

1.8 細(xì)胞活力檢測

轉(zhuǎn)染24 h后，將表達(dá)TCTP siRNA和 scramble siRNA的PCI55，MiaPaca-2細(xì)胞消化，分別以每孔3 000個細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每個時間點做5個平行樣本，將培養(yǎng)板在37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)。分別于圖示時間向每孔加入10 μL CCK-8檢測試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)溫育2 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度值(A)，計算每5孔的A值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.9 細(xì)胞周期與凋亡分析

PCI55和MiaPaca-2細(xì)胞分別以每孔2×105密度接種于6孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞懸液體積2 mL。將細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染TCTP siRNA和 scramble siRNA，在37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞(培養(yǎng)基上清液一起收集)，1 000 r/min，離心5 min，然后細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗兩遍。用1倍結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度到1×106個細(xì)胞/mL。接著加入5 μL Annexin V-FITC及1 μL 100 μg/mL的PI工作液，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。最后加入1倍結(jié)合緩沖液400 μL，輕輕混勻，用流式細(xì)胞檢測儀器檢測細(xì)胞凋亡。

2 結(jié) 果

2.1 TCTP在胰腺癌組織中異常高表達(dá)

胰腺癌組織免疫組化染色結(jié)果顯示，TCTP存在于胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在胰腺導(dǎo)管癌上皮細(xì)胞中異常高表達(dá)，而在癌旁正常的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中則不表達(dá)(圖1A，B)。當(dāng)用兔IgG來代替抗TCTP抗體作為陰性對照時，結(jié)果并沒有陽性反應(yīng)，說明上述免疫組化染色反應(yīng)具有特異性(圖1C)。

2.2 TCTP在胰腺癌細(xì)胞中異常高表達(dá)

因為TCTP在胰腺癌組織中異常高表達(dá)，因此我們進(jìn)一步檢測了人胰腺癌細(xì)胞系PCI35、PCI55、MiaPaca-2、BxPc-3、PANC-1和L3.6pL中TCTP的表達(dá)情況。RT-PCR和蛋白免疫雜交結(jié)果顯示，實驗的6株胰腺癌細(xì)胞中，在mRNA水平和蛋白表達(dá)水平均檢測到TCTP的表達(dá)，并且不同的胰腺癌細(xì)胞系中TCTP的表達(dá)不盡相同，但是都明顯高于正常HEK293細(xì)胞(圖2A，B)。免疫熒光染色結(jié)果進(jìn)一步顯示TCTP存在于PCI55細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，成顆粒狀分布(圖 2C)。

2.3 沉默TCTP表達(dá)通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程和促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而抑制細(xì)胞增殖

利用siRNA技術(shù)沉默胰腺癌細(xì)胞中TCTP，觀察其對胰腺癌細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響。PCI55細(xì)胞轉(zhuǎn)染TCTP siRNA和scramble siRNA后，Western blot檢測兩組細(xì)胞中的TCTP含量，結(jié)果顯示，干擾組中的TCTP蛋白表達(dá)明顯低于對照組(圖3A)，沉默率達(dá)95%以上，說明沉默胰腺癌細(xì)胞中TCTP實驗成功。沉默TCTP的PCI55細(xì)胞增殖速度顯著慢于scramble對照組(圖3B)。同時PCI55細(xì)胞中TCTP被沉默后，細(xì)胞G0/ G1期比例顯著增加，S期、G2/M期細(xì)胞比例顯著降低(圖3C)，伴隨凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加(圖3D)。在MiaPaca-2胰腺癌細(xì)胞中得到了相似的結(jié)果。

圖 1 免疫組化檢測TCTP在胰腺癌組織中表達(dá)情況(400×)Fig. 1 Aberrant expression of TCTP in human pancreatic cancer tissue detected by immunohistochemistry (400×).

圖 2 TCTP 在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況Fig. 2 Constitutive expression of TCTP in human pancreatic cancer cell lines

2.4 TCTP通過上調(diào)Bcl-xL的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡

Western blot結(jié)果顯示，在胰腺癌細(xì)胞株P(guān)CT55、PCI35、PANC-1、和MiaPaca-2中的TCTP表達(dá)量依次遞減的同時，Bcl-xL在上述細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量也呈相應(yīng)的遞減趨勢(圖4A)，提示在胰腺癌細(xì)胞中TCTP可能影響B(tài)cl-xL的表達(dá)。當(dāng)用TCTP siRNA沉默PCI55和MiaPaca-2細(xì)胞中的TCTP后，Bcl-xL表達(dá)量也隨之下降(圖4B)。

圖 3 沉默TCTP表達(dá)對胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為影響Fig. 3 The effect of TCTP silence on biological behavior of pancreatic cancer cell lines PCI55 and MiaPaca-2

圖 4 TCTP 對Bcl-xL表達(dá)的影響Fig. 4 The effect of TCTP on Bcl-xL expression

3 討 論

胰腺癌是一種常見的惡性腫瘤，病死率高，5年生存率＜5%，由于大多數(shù)患者診斷時已屬晚期，無法進(jìn)行手術(shù)和放射治療，幾種常用的化療藥物也并不能取得很好的療效，并且容易產(chǎn)生耐藥，所以亟待開發(fā)新的、有效的分子靶向藥物治療胰腺癌。

目前為止，TCTP 已被證明在肝癌、結(jié)直腸癌中發(fā)揮重要作用，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TCTP在胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞株中異常高表達(dá)，而在正常的胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中不表達(dá)。因此，我們推測TCTP在胰腺癌中也發(fā)揮著重要的作用。

TCTP在腫瘤的發(fā)生，細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)，應(yīng)激反應(yīng)，基因調(diào)節(jié)，熱休克反應(yīng)，甚至是免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著一系列重要的生物學(xué)作用［14,15］。在HeLa 細(xì)胞中過表達(dá) TCTP能夠部分抑制 Na-K-ATPase的活性使EGFR的磷酸化增強(qiáng)，激活Ras/Raf/ERK信號通路；同時可以激活PI3K/Akt 信號通路和使 PLC 的磷酸化增強(qiáng)。這些信號通路對細(xì)胞的生長和增殖具有很重要的調(diào)控作用［16］。Chfr是一個細(xì)胞周期檢驗點蛋白，在細(xì)胞周期進(jìn)程和腫瘤抑制上起著重要的作用，TCTP在體內(nèi)能與 Chfr 相互作用，通過調(diào)節(jié)Chfr的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程［17］。利用 RNAi下調(diào)TCTP的表達(dá)，明顯減少細(xì)胞的數(shù)量，而不影響細(xì)胞的大小，說明細(xì)胞有絲分裂明顯變慢。進(jìn)一步研究顯示，下調(diào)TCTP 的表達(dá)使細(xì)胞周期 G1期明顯延長，而G2/M 期的標(biāo)志蛋白 cyclin A1和cyclin B1 的表達(dá)明顯降低和延遲［18］。除此之外，TCTP還能和微管蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞的有絲分裂過程［19］。因此，TCTP對細(xì)胞的周期調(diào)控起著非常重要的作用。過表達(dá)TCTP能夠抑制依托泊苷(etoposide)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；干擾 TCTP 可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3,20］。在細(xì)胞內(nèi) TCTP能與抗凋亡蛋白Mcl1相互作用，通過抑制MCL-1的泛素化降解增強(qiáng)MCL-1的穩(wěn)定性，從而發(fā)揮抗凋亡作用［4］。最近的研究也證實了TCTP能夠與TSC-22和p53 相互作用，促進(jìn)TSC-22和p53的降解，從而抑制由TSC-22和p53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［21-22］。我們的研究結(jié)果顯示，沉默胰腺癌細(xì)胞中內(nèi)源性TCTP蛋白表達(dá)，顯著抑制細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞周期進(jìn)程，增加細(xì)胞凋亡。

Bcl-xL是Bcl-2家族的重要成員，是一類具有抗凋亡作用的蛋白，在維持細(xì)胞生存中起關(guān)鍵作用。有報道顯示，在T細(xì)胞激活過程中，TCTP蛋白與Bcl-xL蛋白同時表達(dá)上調(diào)；而且通過反義核酸技術(shù)降低T細(xì)胞中的TCTP時，T細(xì)胞的凋亡顯著增加。此外，TCTP蛋白的N末端是TCTP與Bcl-xL相互結(jié)合和發(fā)揮抗凋亡作用必不可少的［23］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TCTP異常高表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株中，Bcl-xL也呈高表達(dá)狀態(tài)。沉默PCI55和MiaPaca-2胰腺癌細(xì)胞中的TCTP蛋白，可下調(diào)Bcl-xL蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。說明在胰腺癌細(xì)胞中異常高表達(dá)的TCTP通過上調(diào)Bcl-xL表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用，從而促進(jìn)胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，本研究結(jié)果證實，在胰腺癌中存在一條新的抗凋亡途徑TCTP-Bcl-xL，并且在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。通過靶向分子阻斷TCTP-Bcl-xL途徑，可能為臨床治療胰腺癌提供新的思路。

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Aberrant expression of TCTP protein inhibits cell apoptosis by up-regulating Bcl-xL in human pancreatic cancer

ZHANG Fei1, WANG Zhen1, ZHANG Ping1, ZHANG Bo2, YANG Wen-tao3, LI Yingyi1(1.Cancer Research Institute; 2.Department of Pancreas and Hepatobiliary, Pancreatic Cancer Institute; 3.Department of Pathology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

LI Ying-yi E-mail: liyingyi@fudan.edu.cn

Background and purpose: Translationally controlled tumor protein (TCTP) is a growth-related protein, and involves in promoting cell proliferation and inhibiting cell apoptosis. A lot of evidence shows there is an overexpression of TCTP in liver cancer, colon cancer and other gastrointestinal tumors. However there is no any evidence about TCTP in pancreatic cancer. The present study aimed to investigate the role and mechanism of TCTP in pancreatic carcinogenesis to find new molecular targets and to provide a basis for targeted therapy of pancreatic cancer. Methods: Immunohistochemistry, Western immunoblot analysis, RT-PCR, immunofluorescence analysis, siRNA transfection, cell counting kit 8 (CCK-8) assays, cell cycle and cell apoptosis analysis were used. Results: TCTP was overexpressed in pancreatic cancer tissues and cancer cells. Moreover, silencing TCTP expression by siRNA arrested cell cycle progression, promoted cell apoptosis and eventually inhibited cell proliferation. Furthermore, Bcl-xL protein expression was positively correlatived with TCTP expression in pancreatic cancer cells, and silencing TCTP downregulated Bcl-xL expression. Conclusion: TCTP is overexpressed in human pancreatic cancer, which upregulates Bcl-xL to inhibit cell apoptosis, and eventually promotes pancreatic carcinogenesis.

TCTP; Pancreatic cancer; Bcl-xL; siRNA

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.05.001

R735.9

：A

：1007-3639(2013)05-0321-07

2013-03-13

2013-05-16）

國家自然科學(xué)基金面上項目(No：30973476，812727)；上海市浦江人才計劃(No：10PJ1402100)；復(fù)旦大學(xué)“985工程”三期腫瘤研究項目Ⅱ(No：985Ⅲ-YFX0102)。

李影奕 E-mail:liyingyi@fudan.edu.cn