張 琳， 郝選明

（華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510631）

長期遞增負(fù)荷運(yùn)動中骨髓和胸腺趨化因子CCR9、CCL25的應(yīng)答性特征

張 琳， 郝選明

（華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510631）

目的：研究對骨髓和胸腺細(xì)胞具有歸巢作用的趨化因子受體CCR9和配體CCL25在長期遞增負(fù)荷運(yùn)動中的應(yīng)答性特征，探討長期運(yùn)動影響T細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：將SD大鼠隨機(jī)分為運(yùn)動組和對照組，運(yùn)動組進(jìn)行遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練6周，每周6次，每天30 m in。第1周運(yùn)動負(fù)荷為10 m.m in-1，第2周為20 m.m in-1，此后每周增加5 m.m in-1，至6周時(shí)達(dá)40 m.m in-1。分別于第0、2、4、6周末，利用ELISA技術(shù)測定安靜狀態(tài)、運(yùn)動后即刻和運(yùn)動后3 h骨髓和胸腺中CCR9和CCL25表達(dá)水平。結(jié)果：骨髓和胸腺中的CCR9、CCL25呈現(xiàn)幾乎相反的應(yīng)答性變化。結(jié)論：隨著遞增負(fù)荷運(yùn)動的進(jìn)程，骨髓中的趨化因子受體CCR9和配體CCL25總體水平越來越高，且越來越難以恢復(fù)，表明骨髓歸巢因子信號需求越來越強(qiáng)；而胸腺CCR9、CCL25總體水平越來越低，越來越難恢復(fù)，表明胸腺微環(huán)境紊亂程度越來越高。這應(yīng)是受長期遞增負(fù)荷運(yùn)動影響，T細(xì)胞歸巢及發(fā)育受阻且功能逐步下降的重要機(jī)理之一。

遞增負(fù)荷運(yùn)動；運(yùn)動性免疫抑制；趨化因子；骨髓；胸腺；免疫調(diào)節(jié)

Author’s addressSchool of Physical Education&Sports Science，South China Normal University，Guangzhou 510631，Guangdong Province，China

T細(xì)胞在胸腺增殖分化和成熟，但胸腺細(xì)胞沒有自我更新能力，因此，骨髓中的造血祖細(xì)胞需要?dú)w巢于胸腺才能維持T細(xì)胞的發(fā)育。祖細(xì)胞從骨髓歸巢入胸腺的過程類似于成熟白細(xì)胞的歸巢，包括選擇素介導(dǎo)對脈管內(nèi)皮的弱黏附，再通過整合素的強(qiáng)黏附，以及祖細(xì)胞滲出［1-2］。這些一系列定向的、協(xié)調(diào)有序的歸巢事件需要細(xì)胞間相互作用以及多種因子的參與［3］，其中選擇素介導(dǎo)對脈管內(nèi)皮的弱黏附過程必須伴隨趨化因子信號。CC趨化因子配體25（CC chemokine ligand 25，CCL25）是新近發(fā)現(xiàn)的CC趨化因子家族成員。已有研究結(jié)果顯示，趨化因子CCL25及其受體CC趨化因子受體9（CC chemokine receptor 9，CCR9）參與骨髓T前體細(xì)胞歸巢入胸腺［4］，以及未成熟胸腺細(xì)胞在胸腺基質(zhì)中的遷移［5］。本實(shí)驗(yàn)對這些具有歸巢作用的趨化因子進(jìn)行研究，觀察它們在6周遞增負(fù)荷運(yùn)動中應(yīng)答與恢復(fù)特征，為運(yùn)動性免疫抑制的調(diào)節(jié)機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象 8周齡雄性SD大鼠128只（購自廣東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號為粵SCXK2008-0020，No.0043379，粵 監(jiān) 證 字F2008A002），隨機(jī)將其分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。對照組32只，正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)，分別于第0、2、4、6周（WK0、WK2、WK4和WK6）取樣，測試相同指標(biāo)，用于判別大鼠生長對各指標(biāo)的影響。實(shí)驗(yàn)組96只進(jìn)行6周遞增負(fù)荷跑臺運(yùn)動訓(xùn)練。

1.2 運(yùn)動訓(xùn)練與取樣 遞增負(fù)荷跑臺訓(xùn)練6周，每周6 d，每天1次，每次30 min。第1周運(yùn)動負(fù)荷為10 m·min-1，第2周為20 m·min-1，隨后，每周遞增負(fù)荷增量5 m·min-1，至第6周，達(dá)到40 m·min-1最大負(fù)荷強(qiáng)度。取樣時(shí)間：第0周，即未經(jīng)訓(xùn)練的大鼠于安靜狀態(tài)（A）、一次性運(yùn)動（10 m·min-1，30 m in）后即刻（J）及運(yùn)動3 h取樣；第2、4、6周，每周最后一次訓(xùn)練完成后48 h取樣，取樣日進(jìn)行與上周相同負(fù)荷的跑臺運(yùn)動，分別在安靜狀態(tài)（A）、運(yùn)動后即刻（J）、運(yùn)動后3 h（3 h），無菌取大鼠骨髓和胸腺。

1.3 測試指標(biāo)及方法 運(yùn)用ELISA方法測定歸巢因子骨髓和胸腺CCL25、CCR9水平，ELISA試劑購自武漢華美公司，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X—± SD）表示，用PASW Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理；組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，P＜0.05為差異具有顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各周對照組骨髓、胸腺組織CCR9、CCL25的變化狀態(tài)（圖1） 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各對照組（C組）骨髓和胸腺組織中的CCR9、CCL25各周之間無顯著性差異（P＞0.05），可以認(rèn)為6周生長對這些指標(biāo)無顯著影響。以下主要探討各周各組對運(yùn)動訓(xùn)練的應(yīng)答性特征。

圖1 各周對照組骨髓、胸腺組織CCR9、CCL25的變化情況Figure 1. Changes of CCR9 and CCL25 in Bone Marrow and Thymus of Control Group in Different Weeks

圖2 骨髓CCR9各周應(yīng)答性變化情況Figure 2. Response of CCR9 in Bone Marrow in Different Weeks

圖3 胸腺CCR9各周應(yīng)答性變化情況Figure 3. Response of CCR9 in Thymus in Different Weeks

2.2 骨髓、胸腺組織CCR9的應(yīng)答性變化（圖2、圖3）大鼠在6周遞增負(fù)荷的跑臺訓(xùn)練中，骨髓和胸腺中的CCR9呈現(xiàn)幾乎相反的應(yīng)答性變化：負(fù)荷初次應(yīng)答的第0周，以及第2周末和第4周末運(yùn)動即刻均明顯上升，恢復(fù)3 h下降，呈倒“V”型應(yīng)答曲線；第6周末，則在運(yùn)動后呈持續(xù)升高趨勢。在遞增負(fù)荷的不同階段它們的應(yīng)答幅度也不同：第0周J組大鼠骨髓CCR9含量與A組相比上升（P＜0.05），運(yùn)動后3 h組下降，略高于A組（P＞0.05）；第0周J組大鼠胸腺組織CCR9含量與A組相比下降（P＜0.01），運(yùn)動后3 h組恢復(fù)。各運(yùn)動組在第2周、4周骨髓CCR9含量均高于A組（P＜0.05或P＜0.01），其中第2周和第4周J組與A組比較均顯著性上升（P＜0.01），3 h組與J組相比下降（P＜0.01），但均高于A組。J組、3 h組在第2周、4周胸腺CCR9含量低于A組（P＜0.01），3 h組與J組相比上升（P＜0.01），但均低于A組。在第6周各運(yùn)動組骨髓CCR9含量高于A組（P＜0.01），且3 h組仍高于J組（P＞0.05）；在第6周各運(yùn)動組胸腺CCR9含量均低于A組（P＜0.01），且3 h組仍低于J組（P＞0.05）。

2.3 骨髓、胸腺組織CCL25的應(yīng)答性變化（圖4、圖5）

圖4 骨髓CCL25各周應(yīng)答性變化情況Figure 4. Response of CCL25 in Bone Marrow in Different Weeks

圖5 胸腺CCL25各周應(yīng)答性變化情況Figure 5. Response of CCL25 in Thymus in Different Weeks

大鼠在6周遞增負(fù)荷的跑臺訓(xùn)練中，CCL25的應(yīng)答性特征與CCR9相似，在遞增負(fù)荷的不同階段它們的應(yīng)答幅度也不同：第0周J組大鼠骨髓CCL25含量與A組相比上升（P＜0.05），運(yùn)動后3 h組略高于對照組，但無顯著性意義（P＞0.05）；第0周J組大鼠胸腺組織CCL25含量與A組相比下降（P＜0.01），運(yùn)動后3 h組高于J組（P＞0.05），但低于A組（P＞0.05）。J組骨髓CCL25含量在第2、4周高于A組（P＜0.05或P＜0.01），3 h組與J組相比下降。J組胸腺CCL25含量在第2、4周低于A組（P＜0.05或P＜0.01），3 h組與J組相比上升。在第6周J組骨髓CCL25含量高于A組（P＜0.05），且3 h組仍高于J組（P＞0.05）；在第6周J組胸腺CCL25含量低于A組（P＜0.05），3 h組與J組相比無顯著性差異（P＞0.05）。

3 分析與討論

骨髓T細(xì)胞前體歸巢入胸腺以及胸腺細(xì)胞在胸腺不同區(qū)域的遷移過程中，趨化因子及其受體表達(dá)起重要的調(diào)節(jié)作用。雖然多種骨髓細(xì)胞有T譜系分化潛能，但表達(dá)CCR9的亞群優(yōu)先歸巢入胸腺。其中，造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells，HSCs）缺乏表面表達(dá)CCR9，不能歸巢入胸腺；而多能祖細(xì)胞（multipotent progenitors，MPPs）和共同淋巴樣祖細(xì)胞（common lymphoid progenitors，CLPs）2種亞型的表面表達(dá)CCR9，能優(yōu)先地歸巢入胸腺。CCL25能夠誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞亞群、胎兒血前胸腺細(xì)胞和新生兒胸腺祖細(xì)胞歸巢和定植于胸腺，阻斷CCL25致使祖細(xì)胞進(jìn)入胎兒胸腺減少［6］。

另外，CCL25可通過CCR9傳遞胸腺細(xì)胞的發(fā)育和遷移信號，促進(jìn)胸腺細(xì)胞的發(fā)育和成熟。L.Carramolino等［7］研究報(bào)道，胸腺中的CCR9正常情況下主要表達(dá)于CD4-CD8-T雙陰性（double-negative，DN）細(xì)胞、CD4+CD8+T雙陽性（double-positive，DP）細(xì)胞及CD8+T單陽性（single-positive，SP）細(xì)胞。當(dāng)DN和DP細(xì)胞上的CCR9與CCL25相互作用后，CCL25誘導(dǎo)細(xì)胞Ca2+的移動從而促進(jìn)其向胸腺趨化運(yùn)動，這些細(xì)胞在胸腺先后經(jīng)歷陽性選擇和陰性選擇后，主要分化發(fā)育成為CD4+T和CD8+T單陽性T細(xì)胞，隨后CCR9在CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)大量減少，而在CD8+T細(xì)胞的表達(dá)基本不變，表明胸腺CCR9、CCL25含量對T細(xì)胞亞群分化有較大程度影響。

為探討運(yùn)動性免疫抑制過程中CCR9、CCL25對骨髓祖細(xì)胞胸腺歸巢的作用及胸腺細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究選取骨髓和胸腺組織，初步研究了趨化因子CCL25、CCR9在骨髓和胸腺組織中的表達(dá)規(guī)律。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，CCL25、CCR9在骨髓和胸腺組織中均有表達(dá)，6周遞增負(fù)荷跑臺運(yùn)動過程中，骨髓和胸腺中CCR9、CCL25呈現(xiàn)不同的應(yīng)答趨勢：骨髓中CCR9、CCL25呈現(xiàn)先上升再回落的倒“V”型曲線，而胸腺中CCR9、CCL25呈現(xiàn)先下降再回升的“V”型曲線。在遞增負(fù)荷的不同階段，CCR9、CCL25應(yīng)答幅度不同：其中第0周運(yùn)動后即刻骨髓中CCR9、CCL25水平升高，而胸腺中的水平下降，表明CCR9、CCL25對運(yùn)動負(fù)荷應(yīng)答非常敏感，一次性運(yùn)動即可引起骨髓中趨化因子及其受體的升高而胸腺水平下降。第2周時(shí)應(yīng)答幅度最大，運(yùn)動后即刻組骨髓中CCR9、CCL25顯著性升高，而在胸腺中顯著性下降。第4周時(shí)應(yīng)答幅度最大，運(yùn)動組骨髓CCR9、CCL25與第2周相比顯著性下降，但仍高于第0周水平；胸腺CCR9、CCL25水平與第2周相比顯著性升高。第6周運(yùn)動組骨髓CCR9、CCL25顯著性上升，但在胸腺再次下降。在前4周運(yùn)動組中，胸腺CCR9、CCL25水平在3 h組均有所恢復(fù)，但在第6周沒有恢復(fù)的趨勢。這表明隨著免疫抑制的進(jìn)程，胸腺CCR9、CCL25水平逐漸下降。

胸腺CCR9、CCL25水平逐漸下降趨勢可能會影響胸腺細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)程，其機(jī)制可能是：胸腺CCR9、CCL25水平下降，不能維持未成熟DN細(xì)胞在胸腺不同位置的遷移，DN細(xì)胞不能準(zhǔn)確、及時(shí)地遷移進(jìn)入促使其發(fā)育的胸腺部位，使DN細(xì)胞無法獲得有效的胸腺微環(huán)境，胸腺DN細(xì)胞的分化增殖異常，繼而抑制下游DP雙陽性細(xì)胞的擴(kuò)增，產(chǎn)生更強(qiáng)的分化抑制效應(yīng)，導(dǎo)致SP單陽性細(xì)胞亞群數(shù)量下降，比例失衡。由上述結(jié)果可推測，胸腺CCR9、CCL25水平下降可能是胸腺細(xì)胞發(fā)育受損的重要因素。

骨髓CCR9、CCL25的動態(tài)變化規(guī)律與胸腺相反，在遞增負(fù)荷運(yùn)動過程中也出現(xiàn)了波動，呈現(xiàn)先上升再回落的倒“V”型曲線，最終隨免疫抑制程度的加深而上升。其機(jī)制一方面可能是由于胸腺結(jié)構(gòu)持續(xù)性破壞，胸腺萎縮和胸腺祖細(xì)胞在運(yùn)動性免疫抑制過程中逐漸減少，需要更多的骨髓祖細(xì)胞歸巢入胸腺，機(jī)體在運(yùn)動應(yīng)激過程中，盡力維持其穩(wěn)態(tài)，相應(yīng)地加強(qiáng)了上游骨髓趨化因子的需求信號，胸腺部位趨化因子越缺乏，骨髓信號越強(qiáng)。另一方面，在病理研究中，有報(bào)道CCR9、CCL25的表達(dá)與淋巴細(xì)胞的募集相關(guān)，而且它們在疾病發(fā)生時(shí)的高表達(dá)很可能與疾病發(fā)生時(shí)免疫細(xì)胞對其他組織和系統(tǒng)的遷移、浸潤密切相關(guān)。CCR9的活化能夠提供細(xì)胞存活的信號，從而有可能增強(qiáng)病理細(xì)胞的生存和增殖能力［8］，因而有可能是一種病情加重的信號；因此，在骨髓中CCR9、CCL25的表達(dá)隨免疫抑制加劇而表達(dá)量增加的機(jī)制及其生物學(xué)意義有待進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

CCR9和CCL25的應(yīng)答性變化與遞增負(fù)荷運(yùn)動的進(jìn)程有關(guān)。骨髓中CCR9和CCL25的上升可能是由于胸腺持續(xù)性破壞，機(jī)體為盡力維持其穩(wěn)態(tài)而加強(qiáng)了上游骨髓歸巢因子的需求信號。胸腺CCR9和CCL25下降可能導(dǎo)致胸腺微環(huán)境紊亂，從而影響胸腺細(xì)胞發(fā)育。

隨著遞增負(fù)荷運(yùn)動的進(jìn)程，骨髓中的趨化因子受體CCR9和配體CCL25總體水平越來越高，且越來越難以恢復(fù)，表明骨髓歸巢因子信號需求越來越強(qiáng)。

在胸腺中趨化因子受體CCR9和配體CCL25總體水平越來越低，恢復(fù)也越來越難，表明胸腺微環(huán)境紊亂程度越來越大。

胸腺微環(huán)境的破壞，歸巢因子作用的減弱，應(yīng)是受長期遞增負(fù)荷運(yùn)動影響，T細(xì)胞歸巢及發(fā)育受阻且功能逐步下降的重要機(jī)理之一。

［1］ Cyster JG.Chemokines，Sphingosine-1-Phosphate，and Cell Migration in Secondary Lymphoid Organs［J］.Annu Rev Immunol，2005（23）：127-159

［2］ Rosen SD.Ligands for L-Selectin：Homing，Inflammation，and Beyond［J］.Annu Rev Immunol，2004（22）：129-156

［3］ Anderson G，Jenkinson E J.Lymphostromal Interactions in Thym ic Development and Function［J］.Nat Rev Immunol，2001，1（1）：31-40

［4］ Zabel B A，Agace W W，Campbell J J，et al.Human G Protein-Coupled Receptor GPR-9-6/CC Chemokine Receptor 9 is Selectively Expressed on Intestinal Homing T Lymphocytes，Mucosal Lymphocytes，and Thymocytes and is Required for Thymus-Expressed Chemokine-Mediated Chemotaxis［J］.JExp Med，1999，190（9）：1241-1256

［5］ Majka M，Janowska-Wieczorek A，Ratajczak J，et al. Stromal-Derived Factor 1 and Thrombopoietin Regulate Distinct Aspects of Human Megakaryopoiesis［J］.Blood 2000，96（13）：4142-4151

［6］ Liu C，Ueno T，Kuse S，et al.The Role of CCL21 in Recruitment of T Precursor Cells to Fetal Thymi［J］. Blood，2005，105（1）：31-39

［7］ Carramolino L，Zaballos A，Kremer L，et al.Expression of CCR9β-Chemokine Receptor is Modulated in Thymocyte Differentiation and is Selectively Maintained in CD8+T Cell from Secondary Lymphoid Organs［J］.Blood，2001，97（4）：850-857

［8］ Youn B S，Kim Y J，Mantel C，et al.Blocking of c-FLIP（L）-Independent Cycloheximide-Induced Poptosis or Fas-Mediated Apoptosis by the CC Chemokine Receptor 9/ TECK Interaction［J］.Blood，2001，98（4）：925-933

Responsive Characteristics of Chemotactic Factors CCR9/CCL25 in Bone M arrow and Thymus during Long-Term Incremental Exercise

∥ZHANG Lin，HAO Xuanming

Objectives：It is to observe the responsive characteristics of CCR9/CCL25，the two chemotactic factors in bone marrow and thymus during long-term incremental exercise and to explore the regulative mechanism of T lymphocyte development with long-term exercise.Methods：Sprague-Dawle rats were randomly divided into control and exercise group.Exercise protocol：treadmill exercise，successive 6 weeks，6 days per week，30 minutes per day，10 m·m in-1in week 1，20 m·m in-1in week 2，with 5 m·m in-1increment in the following weeks till it reached 40m·min-1in the 6thweek.Samples were taken before exercise，at rest，immediately after exercise and 3 hours after exercise，respectively at the end of week 2，4 and 6.CCR9/CCL25 was tested by ELISA.Results：CCR9/CCL25 in bone marrow and thymus presented almost opposite responsive pattern during 6-week incremental exercise. Conclusions：There is an increasing grow th for CCR9/CCL25 level in bone thymus and more difficulty of recovery during the incremental exercise，which means an increasing grow th of demands for chemotactic factors in bone marrow.On the other hand，a decreasing grow th for CCR9/CCL25 level in thymus and more difficulty of recovery show the increasingly big disorder for thymus micro-environment.It should be one of the important mechanisms for T lymphocyte development impairment and gradually downgrading function with long-term incremental exercise.

incremental exercise；mobility immune suppression；chemotactic factor；bone marrow；thymus；immune regulation

G804

A

1000 -5498（2013）03 -0056 -04

2012 -10 -20；

2013 -02 -06

中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（20110490909）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（S2011040003164，9151063101000059）

張琳（1971 -），女，河南南陽人，華南師范大學(xué)博士后；Tel：13660106216，E- mail：sdtyzl@yahoo.cn

郝選明（1954 -），男，陜西韓城人，華南師范大學(xué)教授，博士，博士生導(dǎo)師；Tel：（020）85211498，E- mail：hxm@scnu.edu.cn