王 薇 ，許 鑫 ，2，胡 戴 ，2，匡長春 ，李 歐 ，2，符旭東

(1.中國人民解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢 430070;2.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢 430065)

紫杉醇(paclitaxel，PTX)是從紅豆杉屬植物中提取出來的一種高效抗腫瘤活性的天然物質(zhì)，具有促進微管蛋白聚合、抑制解聚、抑制細胞有絲分裂的作用[1－2]，臨床主要用于卵巢癌和乳腺癌的治療。目前臨床上使用較多的是紫杉醇注射劑，但注射劑中的溶劑無水乙醇和聚氧乙烯蓖麻油易引起過敏反應(yīng)，且由于缺乏靶向性，副作用較大[3]。因此，紫杉醇脂質(zhì)體靶向制劑成為了研究熱點。本課題組擬研究具有主動靶向功能的長循環(huán)脂質(zhì)體，在他人研究的基礎(chǔ)上，對紫杉醇脂質(zhì)體的處方和工藝進行了優(yōu)化，研制出了包封率高、粒徑較小、穩(wěn)定性好的紫杉醇脂質(zhì)體，以期為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)將紫杉醇脂質(zhì)體的制備、含量測定方法和特性表征報道如下。

1 儀器與試藥

BP211D型電子天平(SARTOTIUS，Amerca);Anke TGL－16G－A型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠);RE－52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);KT－300Y型超聲波藥品處理機;SHZ－Ⅲ型循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠);JY92－2D型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技有限公司);Malvern Nano－ZS90激光粒度儀;JEM－2100(HR)透射電子顯微鏡;Agilent 1100型高效液相色譜儀;透析袋(8000－14000，BIOSHARP);SHZ－82型恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)。紫杉醇(武漢遠城科技發(fā)展有限公司，批號為1007001，純度99.7%);大豆卵磷脂(Sigma);膽固醇(上海伯奧生物科技有限公司);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體制備

精密稱取處方量的膽固醇0.5 g、大豆卵磷脂0.5 g、紫杉醇0.01 g，充分溶解于氯仿中，置250 mL的圓底燒瓶中，將燒瓶置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，于40℃水浴下減壓旋轉(zhuǎn)45 min，以徹底揮去有機溶劑，用含5% －乳糖的pH=7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)10 mL水化，探針超聲6 min后分別過0.45和0.22 μm的聚碳酸脂膜各3次，即得紫杉醇脂質(zhì)體溶液。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:依利特 C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇 －水 －乙腈(23∶41∶36);檢測波長:227 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;進樣量:20 μL。

2.2.2 溶液制備

取異丙醇/無水乙醇/無水乙醚[4]，按體積比為2∶2∶1，混合均勻，作為破乳劑。精密稱取紫杉醇5.0 mg，置10 mL容量瓶中，加適量破乳劑溶解，稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備液。精密量取該貯備液2 mL，置10 mL容量瓶中，加破乳劑稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液(紫杉醇質(zhì)量濃度為100 μg/mL)。精密量取1 mL脂質(zhì)體，置10 mL容量瓶中，加適量破乳劑溶解，稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗:取2.2.2項下的紫杉醇對照品溶液，按上述色譜條件注入液相色譜儀;另取處方量輔料，置10 mL容量瓶中，按擬訂方法制備空白對照溶液，注入液相色譜儀，分別記錄高效液相色譜圖(圖1)，考察系統(tǒng)適用性。結(jié)果表明，在該色譜條件下，輔料對紫杉醇的測定無干擾。

線性關(guān)系考察:分別精密移取2.2.2項下對照品貯備液0.02，0.1，0.2，0.5，1，2，3，5 mL，置 10 mL 容量瓶中，加入破乳劑定容至刻度，搖勻，分別注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定色譜峰面積，以峰面積(A)為縱坐標、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 A=3 933.9 C －919.06，r2=1(n=8)。結(jié)果表明，紫杉醇質(zhì)量濃度在1～250 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗:取同一對照品溶液，重復(fù)進樣6次，按擬訂色譜條件測定色譜峰面積。結(jié)果 RSD=1.01%，表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:分別取2.2.2項下對照品溶液和供試品溶液，分別于放置 0，3，6，12，24，48 h時注入液相色譜儀，記錄峰面積。在上述時間點處的峰面積分別為392 206，392 470，393 450，395 208，394 119，393 417，溶液中紫杉醇的 RSD 為 0.28%，表明對照品溶液和供試品溶液均在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，能滿足測量需要。

加樣回收試驗:精密量取脂質(zhì)體1 mL，置10 mL容量瓶中，分別加入 0.6，0.45，0.33 mL 對照品貯備液，用破乳劑定容至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。每份平行操作2次，分別取20 μL注入液相色譜，以峰面積按外標一點法計算回收率。結(jié)果見表1。

2.3 紫杉醇脂質(zhì)體表征考察

2.3.1 粒徑分布和電荷

取制備好的紫杉醇脂質(zhì)體，適當稀釋后，用Malvern Nano－ZS90激光粒度儀進行測定，平均粒徑在54.6 nm左右，電位－40.9 mV。

2.3.2 形貌觀察

取制備好的紫杉醇脂質(zhì)體，適當稀釋后，滴加在有支持膜的專用銅網(wǎng)上，用3%的磷鎢酸鈉溶液染色后，自然晾干后在透射電鏡下觀察脂質(zhì)體形態(tài)，見圖2?？梢?，脂質(zhì)體的形態(tài)呈圓形或類圓形。

表1 加樣回收試驗結(jié)果(n=9)

圖2 紫杉醇脂質(zhì)體的外觀形態(tài)

2.3.3 包封率及載藥量測定

按照2010年版《中國藥典(二部)》中的相關(guān)規(guī)定，脂質(zhì)體包封率=系統(tǒng)中包封藥量/系統(tǒng)中包封與未包封總藥量×100%。脂質(zhì)體載藥量=藥量/脂質(zhì)體重量×100%。

包封率測定:取1 mL制備好的脂質(zhì)體溶液，加入3 mL破乳劑后水浴超聲15 min，充分破乳后取20 μL進高效液相色譜檢測紫杉醇的含量，得到脂質(zhì)體溶液中總的紫杉醇含量;另取1 mL脂質(zhì)體溶液，在15 000 r/min離心15 min后取上清液[5]，加入3 mL破乳劑后水浴超聲15 min，充分破乳后取20 μL進高效液相色譜檢測紫杉醇的含量，得到脂質(zhì)體溶液中被包載的紫杉醇含量。測得試驗制備的紫杉醇脂質(zhì)體的包封率為(97.95±1.32)%，RSD=1.35%(n=8)。

載藥量測定:將制備好的脂質(zhì)體溶液采用低溫冷凍干燥的方法凍干得到凍干粉，稱取少量的干粉，加入破乳劑/水(3/1，V/V)的混合溶液后水浴超聲15 min，充分破乳后取20 μL進高效液相色譜檢測紫杉醇的含量;另配置紫杉醇的對照品溶液。計算得紫杉醇脂質(zhì)體的載藥量，試驗測得該脂質(zhì)體的載藥量約為2.48%(n=4)。

2.3.4 體外釋放度測定

取紫杉醇脂質(zhì)體溶液2.0 mL，加入透析袋(截留分子量為8 000－14 000)內(nèi)，兩端夾緊后置20 mL的30%乙醇溶液中，于37℃恒溫搖床中以100 r/min的速度持續(xù)震搖。紫杉醇注射液溶為陽性對照。分別在 0，0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24 h 取出1 mL透析液，同時補充相同體積的釋放介質(zhì)，48 h時取出全部的脂質(zhì)體溶液，直接破乳計算出紫杉醇的量。采用高效液相色譜測定，計算紫杉醇的釋放百分率。釋放百分率 F%=At/Ao×100%。其中 F為累積釋放度，At為累積釋放紫杉醇的量，Ao為加入透析袋中紫杉醇的總量。

2.3.5 穩(wěn)定性考察

圖3 紫杉醇注射液和脂質(zhì)體的體外釋藥曲線

將制備好的脂質(zhì)體分別于4℃和室溫(20～25℃)放置，定時觀察脂質(zhì)體溶液的外觀變化并測定包封率。結(jié)果表明，在4℃條件下放置 0，1，2，3，4 周，包封率分別為 97.77% ，94.49% ，93.72% ，86.84% ，82.35%;室溫下放置 0，1，2，4，6 d，包封率分別為 98.76% ，92.33% ，81.27% ，63.91% ，58.78% ，且脂質(zhì)體溶液發(fā)生渾濁，有絮狀物出現(xiàn)。由此可見，脂質(zhì)體溶液應(yīng)在4℃保存。

3 討論

本試驗采用薄膜分散法制備脂質(zhì)體，紫杉醇的最終質(zhì)量濃度為1 g/L，制備的脂質(zhì)體粒徑較小，穩(wěn)定性好，在4℃條件下存放1個月亦沒有藥物析出。體外釋放結(jié)果顯示紫杉醇注射液的釋放曲線符合零級動力學模式(r2=0.992 1)，而脂質(zhì)體溶液的體外釋放曲線符合Higuchi方程(r2=0.991 1)，與紫杉醇注射液相比，脂質(zhì)體具有明顯的緩釋效果。

迄今脂質(zhì)體的制備工藝已較成熟，脂質(zhì)體給藥前的粒徑成為該制劑應(yīng)用的較大障礙，如何制備出粒徑較小的脂質(zhì)體及選擇合適的凍干保護劑和凍干技術(shù)，使脂質(zhì)體凍干粉在復(fù)溶時粒徑改變最少，且同時保持脂質(zhì)體原有的特性，是脂質(zhì)體類藥物必須解決的難題。同時，粒徑較大的脂質(zhì)體容易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)吞噬，靶向到肝腎等部位，而長循環(huán)脂質(zhì)體通過將親水性大分子如聚乙二醇(PEG)等鑲嵌到脂質(zhì)體表面，能降低血液成分(主要是網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的血漿調(diào)理素)對脂質(zhì)體的識別，以降低脂質(zhì)體的血液清除率，延長脂質(zhì)體在血漿中的穩(wěn)定時間，提高藥物的生物利用度[6－7]。本實驗室制備的紫杉醇脂質(zhì)體粒徑較小、穩(wěn)定性好，為后期的長循環(huán)脂質(zhì)體的制備奠定了基礎(chǔ)。

[1]Horwitz SB，Lothstein L，Manfredi JJ，et al.Taxol:mechanisms of action and resistance[J].Ann N Y Acad Sci，1986，466:733 － 744.

[2]Perez EA.Microtubule inhibitors:Differentiating tubulin－inhibiting agents based on mechanisms of action，clinical activity，and resistance[J].Mol Cancer Ther，2009，8(8):2 086 － 2 095.

[3]胡 佳.47例紫杉醇注射液過敏反應(yīng)文獻分析[J].中國藥業(yè)，2012，21(6):53－54.

[4]楊 濤，金大德，崔福德.紫杉醇脂質(zhì)體藥物含量及包封率的測定[J].藥物分析雜志，2008，28(2):231－234.

[5]趙 慧，王堅成，羅春蕾，等.多肽GRGDS修飾的紫杉醇長循環(huán)靶向脂質(zhì)體的體外評價[J].中國新藥雜志，2008，23(17):2 034－2 038.

[6]Yang C，Liu HZ，F(xiàn)u ZX，et al.Oxaliplatin long －circulating liposomes improved therapeutic index of colorectal carcinlma[J].BMC Biotechnology，2011，11:21.

[7]Ko YT，Bhattacharya，Bickel U.Liposome encapsulated polyethylenimine/OND polyplexes for brain targeting[J].J Control Release，2009，133(3):230－237.