朱金釵，郭 洋，向 宇，彭 彬，李君安，唐 中，楊正偉

(1.川北醫(yī)學院形態(tài)定量研究室;2.川北醫(yī)學院細胞化學研究室;3.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，四川 南充 637000)

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筆者實驗室的前期研究顯示，成年大鼠嚴重高血糖合并高血脂5 ～6 周導致附睪內(nèi)精子總數(shù)減少約60%，但睪丸內(nèi)精子細胞總數(shù)的減少僅約15%［1］。考慮到睪丸內(nèi)長形精子細胞有一定程度的滯留［1］，且睪丸網(wǎng)似有增厚［2］，附睪內(nèi)精子大幅減少可能與睪丸內(nèi)精子的淤積或精子向附睪的輸送障礙有關。睪丸內(nèi)精子尚無運動力，其輸送主要取決于Sertoli 細胞分泌的睪丸液(精子輸送的載體)和生殖管道(包括生精小管)的收縮(精子輸送的動力)。鑒于嚴重高糖高脂血癥勢必導致嚴重脫水，而脫水又可能使睪丸液分泌減少，因此本文設計了一個急性脫水模型(禁水)來初步探討脫水是否會影響精子的輸送。

1 材料與方法

1.1 動物與實驗

本文采用的動物是38 只51 ～52 天齡正常雄性Sprague-Dawley 大鼠(體重約67 ～131 g)，由川北醫(yī)學院動物中心提供，均單籠飼養(yǎng)。動物按體重排序(根據(jù)修勻法)后等距隨機［3］分成兩組:對照組(n =18)與實驗組(n =20)。對照組既喂食(顆粒飼料)又喂水，實驗組只喂食不喂水。實驗4 d 后分別從對照組和實驗組隨機抽選9 只和7 只動物取材，5 d后從余下存活動物(對照組和實驗組各9 只和5只)取材(取材前對照組沒有動物死亡，而實驗組共有8 只動物死亡)。

取材時先用戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，然后剖開胸腔充分暴露心臟，用真空采血管直接從左心室采集血液(2 mL 左右)。(實驗組有兩只動物采血不成功，沒有血液標本)緊接著剖開腹腔，取出雙側(cè)睪丸和附睪。

1.2 血液檢查

采血后在3 ～4 h 之內(nèi)測量紅細胞比容(采用美國貝克曼L750 型全自動血細胞分析儀)以及血清鈉、鉀濃度(采用美國貝克曼DXC800 型全自動化分析儀)。從每個動物的血液標本中取樣3 次進行每個指標的測量，以其3 次測量值的均值作為各個動物的結果。

1.3 切片制備

器官標本取出后立即用Bouin 液浸潤固定48 h，然后換入70%乙醇保存。1 周后游離一側(cè)(左側(cè)或右側(cè)，不同動物交替確定)睪丸和附睪，并稱重、測密度以估計器官體積［3］，接著切取組織塊。

大致沿垂直于睪丸、附睪長軸的方向，分別從每個睪丸、每個附睪頭部和每個附睪尾部等距隨機切取厚約2 mm 的兩個組織塊。組織塊經(jīng)乙醇和正丁醇脫水后包埋入甲基丙烯酸樹脂(2-hydroxyethyl methacrylate，德國Leica Microsystems Nussloch GmbH產(chǎn)品)。

從每個組織塊切取1 張切片(20 μm 厚)用于研究。睪丸切片用PAS(過碘酸與Schiff 試劑)和蘇木精染色(各1 h)，附睪切片僅用蘇木精染色(1 h)。

1.4 形態(tài)定量研究

1.4.1 睪丸的形態(tài)定量研究 用體視學圖像系統(tǒng)(丹麥Visiopharm 產(chǎn)品)所配置的光學顯微鏡(日本Olympus，BX51 型)的20× 物 鏡(UPlanSApo，NA 0.75)攝取圖像，在電腦顯示屏上觀察(圖1 是用100 ×物鏡所攝圖像)。從切片左上角開始依次向右、向下、向左、向下、向右……等距(隨機)抽選測試視野(視野間距設定為600 μm)，直至測完整張切片。視野圖像上疊加有4 個(2 ×2)測點(其橫向與縱向間距均為437 μm)和1 個禁線框(位于視野左下角，200 μm×200 μm 大小)。先在切片上表面聚焦，然后向下移動3 μm 聚焦，以此聚焦平面作為測量平面。每2 個視野進行1 個視野的測點計數(shù)(即間隔1 個視野進行測點計數(shù)):觀察記錄位于不同結構(生精小管壁、生精小管腔、間質(zhì))的測點數(shù)。測完后根據(jù)測點數(shù)計算睪丸內(nèi)生精小管、生精小管腔以及間質(zhì)的體積分數(shù)，并進一步結合睪丸體積計算睪丸內(nèi)這些結構的總體積［3］。在每個睪丸的2張切片上，總共計數(shù)了(249 ±46)個測點。

在每個視野上用禁線框根據(jù)禁線法則抽選有管腔的近似圓形或橢圓形的生精小管輪廓，然后測量其直徑(短徑)［3］，并定性判斷其生精細胞是否排列疏松、是否有長形精子細胞滯留［4－5］。生精細胞排列疏松指的是，生精小管輪廓內(nèi)至少可見兩個裂隙，每個裂隙至少可見兩個緊鄰的生精細胞與另兩個緊鄰的生精細胞之間有明顯的裂縫［4］;長形精子細胞滯留指的是，本該出現(xiàn)在生精周期前半期且位于生精小管近腔面的長形精子細胞，卻出現(xiàn)在生精周期后半期的生精小管上，或位于生精小管近基膜的位置，甚至朝向紊亂(即細胞核頭尾端的方向錯亂)［5］，見圖1。在每個睪丸的兩張切片上，總共觀測了(56 ±12)個生精小管輪廓。

1.4.2 附睪的形態(tài)定量研究 如上所述用體視學圖像系統(tǒng)進行測點計數(shù)，不過所用物鏡是100 ×油鏡(UPlanSApo，NA 1.40)，視野間距為200 ～800 μm，每個視野上僅疊加1 個測點。根據(jù)測點計數(shù)分別估計附睪內(nèi)的附睪管、附睪管內(nèi)細胞團和間質(zhì)的體積分數(shù)及其總體積。附睪頭部內(nèi)的所謂附睪管在本文里包括輸出小管，附睪管內(nèi)的細胞團由密集的精子和(或)未成熟生精細胞(主要是球形精子細胞)構成。在每個附睪頭或尾的兩張切片上，總共計數(shù)了(78 ±44)個測點。

1.4.3 附睪管內(nèi)細胞數(shù)的半定量分析 用普通光學顯微鏡的40 ×物鏡觀察附睪切片，盲法(不看切片編號)判斷每張切片附睪管內(nèi)的細胞數(shù)(主要是精子和球形精子細胞)。精子數(shù)分較多和較少兩個(級)結果，球形精子細胞數(shù)分較多、較少和散在3個結果?！拜^多”、“較少”分別指大部分、小部分附睪管腔內(nèi)見成團的細胞，“散在”指僅見少量散在或稀少的細胞(圖2)。每個附睪頭或尾(附睪管內(nèi))的細胞數(shù)，以其兩張切片中細胞數(shù)較多(如果兩張切片的結果不同)的那張切片的結果表示，或以其1張切片的結果表示(如果兩張切片的結果一樣)。

1.5 統(tǒng)計學分析

表1 大鼠脫水相關指標(±s)

表1 大鼠脫水相關指標(±s)

* P≤0.05，兩組指標相比。

對照組(n=18) 實驗組(n=12)體重(g) 113 ±25*78 ±16血細胞比容(%) 36.1 ±2.9* 50.1 ±4.1血清鈉(mmol/L) 144 ±2* 166 ±15血清鉀(mmol/L)5.26 ±0.87 4.75 ±1.23

表2 大鼠睪丸形態(tài)定量結果( ±s)

表2 大鼠睪丸形態(tài)定量結果( ±s)

* P≤0.05，兩組指標相比;#隨機抽選的生精小管輪廓( 有管腔，圓形或橢圓形) 中，可見生精細胞排列疏松或長形精子細胞滯留的小管輪廓所占百分比。

對照組(n=18) 實驗組(n=12)睪丸體積(mm3) 751 ±186*612 ±166生精小管平均直徑(μm) 219 ±18* 204 ±22睪丸內(nèi)生精小管的體積分數(shù)(%) 72.4 ±2.8* 76.2 ±4.9睪丸內(nèi)生精小管的總體積(mm3) 543 ±134 464 ±120睪丸內(nèi)間質(zhì)的體積分數(shù)(%) 27.6 ±2.8* 23.8 ±4.9睪丸內(nèi)間質(zhì)的總體積(mm3) 208 ±57* 148 ±56睪丸內(nèi)生精小管管腔的體積分數(shù)(%) 3.4 ±1.3 4.2 ±2.6睪丸內(nèi)生精小管管腔的總體積(mm3) 25 ±8 27 ±22生精細胞排列疏松的生精小管輪廓數(shù)(%)# 5.9 ±12.5* 29.4 ±27.0有長形精子細胞滯留的生精小管輪廓數(shù)(%)# 14.2 ±11.3*53.5 ±15.5

表3 大鼠附睪內(nèi)精子和球形精子細胞的數(shù)量(半定量觀察結果)

表4 大鼠附睪形態(tài)定量結果(±s)

表4 大鼠附睪形態(tài)定量結果(±s)

* P≤0.05，兩組的附睪頭部或尾部指標相比;#P≤0.05，對照組的附睪頭部與尾部指標相比。

附睪頭部對照組(n=18) 實驗組(n=12)附睪尾部對照組(n=18) 實驗組(n=12)體積(106μm3) 90.0 ±30.0* # 53.2 ±27.3 32.2 ±11.5*23.9 ±11.6附睪管的體積分數(shù)(%) 59.9 ±10.8 62.9 ±9.2 53.2 ±6.9 54.7 ±7.6附睪管的總體積(106μm3) 55.6 ±27.6* # 34.0 ±19.3 17.1 ±6.7* 13.5 ±8.4間質(zhì)的體積分數(shù)(%) 40.2 ±10.8 37.1 ±9.2 46.8 ±6.9 45.4 ±7.6間質(zhì)的總體積(106μm3) 34.5 ±8.6* # 19.2 ±9.6 15.1 ±5.9* 10.5 ±3.9附睪管內(nèi)細胞團的體積分數(shù)(%) 9.2 ±10.7 14.6 ±13.5 8.3 ±12.3* 19.2 ±13.1附睪管內(nèi)細胞團的總體積(106μm3) 10.1 ±12.5# 7.9 ±7.8 3.8 ±7.0*5.3 ±5.5

2 結果

與對照組相比，實驗組動物體重(實驗結束時)減少了30%，血細胞比容和血清鈉水平分別增加了40%和15%，但血清鉀水平無顯著性改變(表1)。

睪丸切片的一般組織學觀察可見實驗組(與對照組相比)主要有以下特征:生精小管壁(生精上皮)內(nèi)的生精細胞排列較疏松，有長形精子細胞滯留;Leydig 細胞核似有皺縮，邊緣不光滑(圖1)。對照組動物有5.9%和14.2%的生精小管輪廓分別可見生精細胞排列疏松、長形精子細胞滯留，而實驗組的這兩個結果分別高達29.4%和53.5%(表2)。定量研究表明，實驗組睪丸的主要變化是:睪丸的體積減少19%，其中生精小管的總體積減少15%(小管直徑縮小7%)，而間質(zhì)的總體積減少29% (表2)。

附睪頭或尾的一般組織學觀察難以看出兩組間有什么不同的形態(tài)特征。半定量分析顯示，實驗組附睪頭部或尾部附睪管內(nèi)的球形精子細胞較多(表3、圖2)。形態(tài)定量研究表明，實驗組附睪頭部、尾部的體積分別減少約41%、26%，其中附睪管以及附睪管之間的間質(zhì)的總體積都減少，間質(zhì)總體積的減少幅度(44%、30%)更大(表4)。不過，附睪頭部或尾部附睪管內(nèi)的細胞團的總體積沒有減少，尾部細胞團的總體積甚至有增加(表4)。

3 討論

從血液化驗指標來看，本文通過禁水成功創(chuàng)建了一個高滲性脫水［6］的動物模型。不過，實驗過程中我們注意到，禁水期間動物的飼料消耗量日漸減少(未發(fā)表數(shù)據(jù))。因此，這種禁水模型不僅可造成脫水，還可能造成營養(yǎng)不良甚至緊張、焦慮。

本文研究顯示，禁水致脫水伴有動物體重下降，器官體積減少。就睪丸與附睪來講，體積減少更多的是間質(zhì)。

從睪丸精子發(fā)生過程的組織學觀察來看，本文所用禁水致脫水的短期模型，并未明顯影響或阻斷精子發(fā)生的各個階段。精子發(fā)生雖仍在繼續(xù)，但明顯有生精細胞排列疏松并脫落以及長形精子細胞滯留的征象。精子發(fā)生繼續(xù)的同時，精子和脫落的未成熟生精細胞從睪丸向附睪的輸送也仍在進行，因為在附睪里我們看到了更多的球形精子細胞。睪丸網(wǎng)的形態(tài)特征也支持這個判斷［7］。這說明，睪丸液這種細胞外液(精子和未成熟生精細胞輸送的載體)的分泌還沒有受到明顯的影響。也許這是因為本文所用短期脫水模型，還處在一個細胞內(nèi)液向細胞外液轉(zhuǎn)移的病理生理過程［6］。因此，禁水致脫水這種模型對精子發(fā)生與輸送的影響，與高糖高脂血癥可能引起的改變［1－2］是不相同的。

本文研究發(fā)現(xiàn)，禁水致脫水使大鼠睪丸內(nèi)的生精細胞排列疏松并大量脫落，這說明脫水容易損害生精細胞與Sertoli 細胞之間的連接結構或粘附分子，或者說生精細胞與Sertoli 細胞之間的連接結構或粘附分子對脫水很敏感。筆者以為，這個發(fā)現(xiàn)或推測值得進一步研究。不過有一點也值得注意，那就是生精細胞如此疏松與脫落，一定程度上可能與所用動物是青春期動物有關。因為本文研究也發(fā)現(xiàn)，正常青春期大鼠附睪管內(nèi)的球形精子細胞較多見，甚至可見其成團分布，其中相對較多且容易分辨的是球形精子細胞，而正常成年大鼠附睪管內(nèi)僅偶爾可見散在的未成熟生精細胞［5，8］。此外，筆者實驗室以前就注意到，精子發(fā)生活躍的較年輕大耳白兔更易出現(xiàn)球形精子細胞脫落的征象［9］。就是說，青春期大鼠睪丸的生精細胞本來就容易脫落，這可能使某些因素(例如禁水致脫水)更易誘導其大量脫落。

本文也發(fā)現(xiàn)，未成熟生精細胞提前脫落伴有長形精子細胞滯留(釋放障礙)。這二者看似矛盾，其實可能是統(tǒng)一的，即生精細胞疏松既導致了生精細胞脫落，也導致了一定程度的長形精子細胞滯留。生精細胞疏松可導致其脫落容易理解，它也可導致長形精子細胞滯留是因為，長形精子細胞的釋放有賴于Sertoli 細胞的功能，而生精細胞排列疏松勢必伴有Sertoli 細胞與長形精子細胞之間的連接問題(事實上生精細胞排列疏松可能就是由于Sertoli 細胞與生精細胞之間的連接問題所致)，從而使Sertoli細胞不能幫助長形精子細胞正常釋放［10］。這種情況下從生精上皮“釋放”的長形精子細胞(附睪內(nèi)所見精子)，可能實際上是隨其他生精細胞一起提前脫落的細胞(圖2)。

本文見實驗組睪丸Leydig 細胞核似有皺縮，那可能是脫水所致。不過，鑒于細胞形態(tài)改變小，細胞數(shù)量也看不出有什么變化，它可能不會影響睪酮分泌，即不會降低睪酮水平(尤其是睪丸內(nèi)睪酮水平)。進一步講，睪酮水平的短期、小幅變化也難以影響睪丸的精子發(fā)生。例如，大鼠睪酮不全撤退即使持續(xù)4 個月，也僅使11.5%的生精小管輪廓出現(xiàn)生精細胞排列疏松［11－12］，睪酮急劇或幾乎完全缺乏(Leydig 細胞幾乎完全破壞所致)7 d 也僅使4.6%的生精小管輪廓出現(xiàn)生精細胞排列疏松［5］。因此我們認為，本文所見禁水致脫水所致睪丸改變可能與睪酮無關;即使有關，關系想必也不大。

本文采用附睪管內(nèi)的精子(和未成熟生精細胞)貯存尚少的青春期大鼠，是為了更敏感的顯示實驗因素對附睪管內(nèi)細胞貯存量的可能影響。因為如果采用附睪內(nèi)已有大量精子貯存的成年動物［5，8］，短短幾天(與精子發(fā)生周期相比)的實驗因素對附睪精子貯存量的影響，即使有的話也相對較小。

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