鐘小明 胡偵明 沈皆亮 甘 強 郝 杰 (重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 40006)

椎間盤退變時，終板退變導致的使髓核營養(yǎng)供應(yīng)減少及代謝產(chǎn)物排出減少，是促進髓核退變的重要因素。白藜蘆醇(RES)是廣泛存在于葡萄酒、水果、中藥中的一種植物抗毒素和抗氧化劑，大量研究表明RES可以活化各種生物體內(nèi)的沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(SIRT1)從而使SIRTl發(fā)揮保護機體、抵抗各種應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的作用，是目前發(fā)現(xiàn)的最好的天然SIRTl激活劑。目前，尚缺乏RES對退變椎間盤細胞抗凋亡及抑制退變方面的研究。本研究探討白藜蘆醇干預對退變椎間盤終板軟骨細胞SIRT1表達的濃度、時間量效關(guān)系，為進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 RES(Sigma，USA)用二甲亞砜(DMSO)配制成0.2 mol/L母液備用，使用之前用含20%胎牛血清的F12-DMEM培養(yǎng)液稀釋成不同濃度的工作液，DMSO終濃度不高0.1%。F12-DMEM培養(yǎng)基(HyClone，USA)，Ⅱ型膠原酶(Sigma，USA)，胰蛋白酶 (Hyclone，USA)，胎牛血清 (Hyclone，USA)，SIRT 一抗(Abcam，USA)，COLA2α1 一抗、aggreean 一抗(Santa Cruz，USA);HRP 標記二抗(GenScript，USA);總 RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(閃晶公司，上海)。JY300C電游儀(北京君意)，UVP GDS8000凝膠成像系統(tǒng)(UVP，USA);FTC3000 real-time PCR 儀(Funglyn Biotech，Canada)。

1.2 方法

1.2.1 人退變椎間盤終板軟骨細胞的分離與培養(yǎng) 退變椎間盤終板軟骨細胞獲取自老年腰椎間盤突出癥患者手術(shù)時刮除的軟骨終板，共6例，年齡64～72歲，平均年齡67.8歲，男3例，女3例;均經(jīng)術(shù)前MRI及術(shù)后病理檢查診斷為“椎間盤退變”。手術(shù)時取得的軟骨終板標本，刀片刮除髓核及纖維環(huán)，剪碎至約1 mm3;PBS液沖洗2遍，離心(200 r/min，3 min)后加入約7～8倍體積的0.25%的胰蛋白酶液，37℃消化15 min，加入2～3 ml含20%FBS的 F12-DMEM培養(yǎng)基終止消化;離心(800 r/min，5 min)，棄上清液，PBS液沖洗2遍，加入含10%胎牛血清的0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃下攪拌消化4 h;200目細胞篩過濾，離心(800 r/min，5 min)，去除上清液，取細胞沉淀，加入含20%胎牛血清的F12-DMEM培養(yǎng)基，吹打細胞，鏡下計數(shù)，按2×104/ml密度種植于50 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次，隔天用倒置顯微鏡觀察、拍照;細胞融合率90%左右時傳代，亦按2×104/ml密度接種。

1.2.2 細胞分組與處理 P2代細胞培養(yǎng)至融合度90%左右時隨機分組，分別進行如下處理:①空白對照組:不加入RES及DMSO，只加入培養(yǎng)基 。②溶劑對照組:加入0.1%DMSO(相當于作為RES溶劑時的最高濃度);③RES干預組:設(shè)置為12.5、25、50、100 μmol/L 等 4 個濃度，分別作用 12、24、48 h。培養(yǎng)中止后收集細胞，進行測定。

1.2.3 細胞形態(tài)學觀察及免疫細胞化學染色鑒定 熒光倒置相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)并拍照。處理后48 h的P2代終板軟骨細胞行細胞爬片，4%多聚甲醛固定20 min，3%過氧化氫室溫孵育10 min;蒸餾水沖洗，PBS浸洗(5 min×3次);5%封閉血清封閉15 min;傾去血清，SIRT1一抗(按說明書稀釋)4℃過夜;PBS沖洗(5 min×3次);滴加生物素標記二抗，37℃孵育20 min;PBS沖洗(5 min×3次);滴加親和素標記的辣根過氧化物酶(HRP)，37℃孵育20 min;PBS沖洗(5 min×3次);DAB顯色試劑盒顯色(鏡下掌握顯色程度);自來水沖洗，蘇木素復染約30 s，自來水洗 30 min，樹脂封片。陰性對照以一抗稀釋液代替一抗。

1.2.4 Western印跡檢測SIRT1蛋白表達水平 棄去培養(yǎng)基，冷PBS漂洗3次;6孔板置于冰面，每孔加入0.5 ml冷RIPA裂解液，用細胞刮子刮取貼壁細胞，將細胞及裂解液溫和地轉(zhuǎn)移至預冷的微量離心管中，冰面晃動裂解30 min;4℃離心(12 000 r/min，10 min)，收集上清液即為蛋白質(zhì)粗提物。BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。上樣前稀釋至相同濃度。等量上樣進行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)至 PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，SIRT1一抗4℃孵育過夜，TBST沖洗3次，每次 10 min;HRP標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，ECL顯色，曝光，UVPGDS8000凝膠成像系統(tǒng)分析條帶的灰度值。以GAPDH做內(nèi)參。

1.2.5 熒光定量PCR檢測SIRT1 mRNA表達水平 按照試劑盒說明書的操作步驟進行總RNA提取及鑒定。SIRT1引物序列正義鏈5'-CAAAGGAGCAGATTAGTAGGCG-3'，反義鏈 5'-CTCTGGCATGTCCCACTATCAC-3'。內(nèi)參 β-actin引物序列:正義鏈5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，反義鏈 5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。配置PCR反應(yīng)體系(2×Premix 25μl，25 pmol/μl引物 1 μl×2，Sybr green I 0.5 μl，模板 cDNA 2 μl，DEPC水0.5μl)，總體積301μl。FTC-3000實時熒光定量PCR儀上進行PCR反應(yīng)并自動分析，條件如下:94℃ 預變性4 min，然后依次以“94℃ 變性20 s、60℃ 退火30 s、72℃ 延伸30 s”循環(huán)，共擴增循環(huán)35次，72℃檢測信號。以β-actin做內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學觀察及免疫組化染色鑒定 原代細胞3 d左右后開始逐漸貼壁，約7～9 d貼壁完全，細胞呈類圓形，輪廓清楚，細胞核呈圓形。10～12 d時細胞融合，連接成片，細胞融合率約80%～90%時適宜傳代。傳代后，細胞于24 h后貼壁完全，于1 w左右細胞單層融合，逐漸變?yōu)殚L梭形。細胞傳至第2、3代時，細胞的形狀仍然保持為長梭形，至第4代時細胞已有部分呈現(xiàn)不規(guī)則多角形改變，呈鋪路石狀，胞體體積變小，生長變慢。COLA2α1和Aggrecan的免疫組織化學染色均可見陽性表達，胞質(zhì)呈棕黃色，而胞核未見染色，符合終板軟骨細胞的特點，見圖1。

圖1 細胞形態(tài)學觀察及免疫組化染色鑒定

2.2 RES干預對SIRT1蛋白表達的影響 采用Western印跡法檢測各樣本SIRTl蛋白表達的變化(圖2)。經(jīng)RES干預后，各組SIRT1蛋白表達均不同程度增加(圖3)。與空白組相比較，濃度在12.5μmol/L、作用24 h，以及濃度在50μmol/L、作用12 h以上方有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);與空白對照組相比，DMSO組SIRT1蛋白表達差異無顯著性(P＞0.05)，提示0.1%DMSO對細胞表達SIRT1蛋白無抑制作用。在對濃度的組間比較中，統(tǒng)計結(jié)果顯示濃度在50μmol/L以上時，RES明顯促進SIRTl蛋白表達，在該濃度范圍內(nèi)組間比較結(jié)果都有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在對作用時間的組間比較中，統(tǒng)計結(jié)果顯示，濃度在25μmol/L以上時，隨時間增加而SIRT1蛋白表達增加，組間比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。因此，可認為 RES對終板軟骨細胞細胞SIRT1蛋白表達的促進增殖作用呈明顯的劑量、時間依賴。見圖3。

圖2 Western印跡檢測各樣本SIRTI蛋白表達

2.3 RES對 SIRT1 mRNA表達的影響 采用熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測各樣本SIRT1 mRNA表達的變化。結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度白藜蘆醇處理12、24、48 h后(圖4)，終板軟骨細胞細胞SIRT1 mRNA表達組間比較差異有顯著性(P＜0.05)。與空白組相比較，作用12 h時任何濃度SIRT1 mRNA表達均無顯著性差異(P＜0.05);濃度在12.5μmol/L、作用48 h，以及濃度在50μmol/L、作用24 h以上方有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);與空白對照組相比，DMSO組SIRT1蛋白表達無顯著性差異(P＞0.05)，提示0.1%DMSO對細胞表達SIRT1蛋白無抑制作用。在對濃度的組間比較中，統(tǒng)計結(jié)果顯示濃度在50μmol/L以上時，RES明顯促進SIRTl蛋白表達，在該濃度范圍內(nèi)組間比較結(jié)果都有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在對作用時間的組間比較中，統(tǒng)計結(jié)果顯示，濃度在25μmol/L以上時，隨時間增加而SIRT1蛋白表達增加，組間比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。因此，可認為RES對DEC細胞SIRT1蛋白表達的促進增殖作用呈明顯的劑量、時間依賴。

圖4 白藜蘆醇對DEC細胞表達SIRT1 mRNA 的影響(2－△△Ct分析法)

3 討論

現(xiàn)已公認椎間盤退變是引起脊柱退行性疾病的主要原因，但引起椎間盤退變的確切機制目前尚不清楚。已有研究表明〔1，2〕，椎間盤是人體最大的缺氧組織，終板軟骨退變，軟骨下椎體骨質(zhì)增生鈣化，導致彌散功能降低，阻礙了髓核獲得所需營養(yǎng)物質(zhì)，同時抑制代謝廢物的排泄，加速并促進了椎間盤的退變。因此，終板軟骨細胞的退變在椎間盤退變的病理過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。

終板軟骨退變既包括軟骨細胞凋亡，也包括細胞外基質(zhì)合成障礙與降解加速導致的軟骨終板功能障礙。軟骨細胞在未失去其表型的狀態(tài)下，主要分泌蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白，蛋白聚糖和Ⅱ型膠原是關(guān)節(jié)軟骨的重要組成成分，對維持關(guān)節(jié)軟骨的生理功能具有重要作用。實驗證實，退變腰椎終板軟骨細胞合成Ⅱ型膠原能力下降〔3〕。因此，Ⅱ型膠原及Aggrecan代謝改變和信息調(diào)控是研究軟骨基質(zhì)代謝障礙的關(guān)鍵靶點。

實驗證實，SIRT1是哺乳動物延緩衰老、延長壽命的關(guān)鍵分子，在細胞周期、代謝、分化等方面發(fā)揮廣泛調(diào)節(jié)作用〔4，5〕。Dvir-Ginzberg等〔6〕證實人關(guān)節(jié)軟骨細胞的SIRT1高表達能夠促進軟骨特異性細胞外基質(zhì)基因〔Aggrecan，collagen 2a(α1)and 2b(α1)，collagen 9(α1)〕的表達。Gagarina等〔7〕證實骨性關(guān)節(jié)炎患者SIRT1可抑制軟骨細胞凋亡。但目前尚無關(guān)于SIRT1在人終板軟骨細胞是否發(fā)揮類似抑制退變及凋亡作用的報道。

RES是一種蒽醌萜類化合物，天然RES廣泛存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹等植物中，被認為具有SIRT1酶活性激動劑的作用，但其具體機制尚有爭議。Borra等〔8〕認為RES與SIRT1共價結(jié)合，導致后者空間構(gòu)象改變，底物的親和力提高。但最近亦有研究者〔9〕對這一觀點提出反對意見，認為RES并非直接作用于SIRT1從而提高其酶活性。

本文的結(jié)果表明，合適劑量及作用時間的RES能夠上調(diào)退變椎間盤軟骨終板細胞SIRT1 mRNA的表達水平，并且增加SIRT1蛋白的合成，提示RES能夠在轉(zhuǎn)染水平上調(diào)SIRT1基因表達，增加細胞內(nèi)SIRT酶蛋白含量，這亦是RES增加SIRT1體內(nèi)催化活性的可能途徑之一。

本實驗雖然證實RES刺激SIRT1 mRNA表達，但尚缺乏二者(RES和SIRT1)在蛋白水平表達相關(guān)性的依據(jù)，因為復雜的轉(zhuǎn)錄后和翻譯水平調(diào)控機制仍可影響其蛋白質(zhì)的合成。為了進一步研究，選擇合適的時間和濃度進一步研究RES對SIRT1和SIRT1 mRNA蛋白表達的影響成為必要。既往研究表明〔10～12〕，RES在多種腫瘤細胞的抑制生長、促進凋亡作用呈現(xiàn)濃度依賴特性，我們的前期試驗表明，RES在退變椎間盤細胞能夠發(fā)揮抑制凋亡、促進細胞外基質(zhì)合成的作用，該作用與RES在腫瘤細胞促進凋亡的作用恰恰相反，因此，此種作用是否亦呈現(xiàn)濃度及時間依賴性，以及合適的劑量、時間如何，目前尚缺乏類似研究。因此，本研究探討了不同濃度及時間的RES對退變椎間盤終板軟骨細胞表達SIRT1的影響，為進一步研究提供合適的白藜蘆醇濃度及作用時間。本研究發(fā)現(xiàn)，在一定劑量及作用時間范圍內(nèi)(濃度在12.5μmol/L、作用24 h，以及濃度在50μmol/L、作用12 h以上)，RES能夠顯著促進已退變椎間盤終板軟骨細胞表達SIRT1蛋白及SIRT1 mRNA，且該作用呈明顯的劑量、時間依賴性。

1 Gruber HE，Gordon B，Williams C，et al.Vertebral endplate and disc changes in the aging sand rat lumbar spine:cross-sectional analyses of a large male and female population〔J〕.Spine，2007;32(23):2529-36.

2 Peng BG，Hou SX，Shi Q，et al.The relationship between cartilage endplate calcification and disc degeneration:an experimental study〔J〕.Chin Med J，2001;114(3):308-12.

3 王 飛，江建明，王鳳龍，等.退變腰椎軟骨終板細胞生物學特征實驗研究〔J〕.南方醫(yī)科大學學報，2010;30(4):871-74.

4 Hou X，Xu S，Maitland-Toolan KA，et al.SIRT1 regulates hepatocyte lipid metabolism through activating AMP-activated protein kinase〔J〕.J Biol Chem，2008;283(29):20015-26.

5 Tang BL.SIRT1，neuronal cell survival and the insulin/IGF-1 aging paradox〔J〕.Neurobiol Aging，2006;27(3):501-5.

6 Dvir-Ginzberg M，Gagarina V，Lee EJ，et al.Regulation of cartilage-specific gene expression in human chondrocytes by SirT1 and nicotinamide phosphoribosyltransferase〔J〕.JBiol Chem，2008;283(52):36300-10.

7 Gagarina V，Gabay O，Dvir-Ginzberg M，et al.SirT1 enhances survival of human osteoarthritic chondrocytes by repressing protein tyrosine phosphatase 1B and activating the insulin-like growth factor receptor pathway〔J〕.Arthritis Rheum，2010;62(5):1383-92.

8 Borra MT，Smith BC，Denu JM.Mechanism of human SIRT1 activation by resveratrol〔J〕.J Biol Chem，2005;280(17):17187-95.

9 Pacholec M，Bleasdale JE，Chrunyk B，et al.SRT1720，SRT2183，SRT1460，and resveratrol are not direct activators of SIRT1〔J〕.J Biol Chem，2010;285(11):8340-51.

10 Marier JF，Chen K，Prince P，et al.Production of ex vivo lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor-alpha，interleukin-1beta，and interleukin-6 is suppressed by trans-resveratrol in a concentration-dependent manner〔J〕.Can JVet Res，2005;69(2):151-4.

11 Wang Y，Leung LK.Pharmacological concentration of resveratrol suppresses aromatase in JEG-3 cells〔J〕.Toxicol Lett，2007;173(3):175-80.

12 王廣秀，浦佩玉，康春生，等.白藜蘆醇對C6鼠膠質(zhì)瘤細胞抑制生長和誘導凋亡的作用〔J〕.中華神經(jīng)外科雜志，2007;23(4):3.