李維，李薇，吳文如#，王緒新（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 50006；.宜都市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，湖北 宜昌 443300）

參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.Perrier）來源于鉅蚓科環(huán)毛蚓屬，是2010年版《中國藥典》（一部）所收載的廣地龍藥材的原動物。廣地龍雖被公認(rèn)為品質(zhì)最佳的地龍藥材，但常因重金屬超標(biāo)而嚴(yán)重影響其臨床用藥安全[1]。為了解決這一質(zhì)量難題，筆者團(tuán)隊曾對誘導(dǎo)養(yǎng)殖條件下參環(huán)毛蚓體內(nèi)的重金屬含量進(jìn)行過實驗研究，結(jié)果表明，蚓體與土壤中Pb和Cd存在濃度依賴關(guān)系[2]。這與國內(nèi)外學(xué)者已確認(rèn)的某些蚓體具有重金屬富集作用的結(jié)果一致[3]。有研究表明，金屬硫蛋白（MTs）能與Ag、Cu、Hg、Pb、Cd、Zn等重金屬穩(wěn)定結(jié)合[4]，是蚯蚓吸收、蓄積、運(yùn)轉(zhuǎn)、排泄重金屬的最主要解毒方式[3]。參環(huán)毛蚓是否存在相同的誘導(dǎo)特性和解毒機(jī)制則一直有待驗證。為此，筆者采用銀飽和分析法測量了蚓體內(nèi)MTs的含量，該法能夠靈敏地反映出生物體內(nèi)MTs水平的變化[5]。其原理就是通過飽和Ag競爭性替換體內(nèi)與MTs結(jié)合的某金屬，從而計算出該金屬誘導(dǎo)的MTs的含量。借此探討不同重金屬對參環(huán)毛蚓誘導(dǎo)產(chǎn)生的MTs的相關(guān)特性。

1 材料

1.1 儀器

RC5 CPWS型高速冷凍離心機(jī)（美國Bio-Rad公司）；876-2型真空干燥箱（上海錦屏儀表有限公司）；AEG-220型電子分析天平（日本島津公司）；THZ-D型臺式恒溫振蕩器（太倉市實驗設(shè)備廠）；JENA novAA400型石墨爐火焰原子吸收光譜儀（德國Analytik Jena公司）。

1.2 試劑

牛血紅蛋白（廣州威佳生物科技公司）；甘氨酸（廣州奇華盛生物技術(shù)有限公司，純度＞99.5%）；Pb（NO3）2、CdCl2、ZnSO4、CuSO4、CaCO3、Tris、鹽酸（1.19 g/ml）、硝酸（1.42 g/ml）、氫氟酸（1.15 g/ml）、高氯酸（1.67 g/ml）、2.5%硝酸，均購于廣州新生試劑公司，所有試劑除硝酸為優(yōu)級純外，其余均為分析純；水為去離子超純水。

1.3 土壤（養(yǎng)殖基質(zhì)）

工業(yè)石英砂（30～40目、80～100目）購于廣州繹豐研磨材料商行；苔蘚土（pH為6～7）采自廣州芳村花鳥市場。參考經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）有關(guān)蚯蚓急毒研究中人工土壤的配制方法配制人工土壤[6]:工業(yè)石英砂69%（含30～40目20%，80～100目80%），苔蘚土10%，CaCO31%，每組處理總質(zhì)量1500 g。

1.4 動物

蚯蚓購自廣東博羅廣地龍規(guī)范化養(yǎng)殖基地，部分在廣東省野外采集，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)李薇教授鑒定為廣地龍原動物參環(huán)毛蚓P.aspergillum（E.Perrier）。選擇性成熟、環(huán)帶明顯的樣品，于人工養(yǎng)殖箱（50 cm×50 cm×50 cm）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，備用。

2 方法

2.1 誘導(dǎo)條件與溶液的制備

分別將 CdCl2、CuSO4、Pb（NO3）2、ZnSO4晶體溶于去離子水，參照《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB 15618-1995）中各級土壤中重金屬濃度配制金屬離子濃度，每個養(yǎng)殖箱中加入溶液量為125 ml。人工土壤中的金屬誘導(dǎo)濃度見表1。

表1 人工土壤中的金屬誘導(dǎo)濃度Tab 1 Inducing concentration of metals in artificial soil

制備0.5mol/L的甘氨酸溶液，以5mol/L的NaOH調(diào)pH值至8.5。制備1000mg/L的Ag標(biāo)準(zhǔn)貯備液:稱取AgNO30.1575 g，溶于適量水中，加3 ml濃硝酸溶液全部溶解后定容至100 ml棕色量瓶中，4℃遮光貯藏。再制備9.27 mmol/L的AgNO3溶液，使每1 ml溶液含1000 μgAg+，于棕色瓶中避光貯藏。試驗時，用上述甘氨酸緩沖液稀釋Ag+至20 μg/ml，貯藏于棕色瓶中，立即使用；將牛血紅蛋白溶于上述甘氨酸溶液中，配成2%（V/V）溶液。

2.2 試驗步驟

2.2.1 參環(huán)毛蚓MTs提取液的制備 參環(huán)毛蚓先在未加金屬誘導(dǎo)液的人工土壤中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，再加入不同濃度金屬誘導(dǎo)液。30 d后，將養(yǎng)殖于其中的參環(huán)毛蚓取出，冼凈后放在濕濾紙上，吐泥（24 h使之排出體內(nèi)污物），乙醇麻醉后解剖，分離外部肌肉和內(nèi)臟，分別加入等體積Tris-鹽酸（0.01mol/L，pH8.6），勻漿，4℃過夜抽提，10000 r/min離心30 min，取上清80℃加熱5min，12000r/min離心20min，取上清加－20℃預(yù)冷的乙醇至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85%，－20℃過夜沉淀，10000 r/min離心30 min，取沉淀溶于0.02 mo1/L的Tris-鹽酸中，10000 r/min離心10 min，取上清用0.02 mo1/L的Tris-鹽酸定容至2 ml，得到外部肌肉和內(nèi)臟的MTs提取液樣品。－20℃貯藏，備用。

2.2.2 銀飽和分析法處理樣品供試液 取0.2 ml蚯蚓MTs提取液于1.5 ml離心管中，加入0.6 ml甘氨酸緩沖液，混合均勻，室溫放置5min；加入20μg/ml的Ag+溶液0.5ml，室溫放置5 min；加入100 μl血紅蛋白溶液，混合均勻；80℃水浴 5 min，然后置于冰水浴中5 min。室溫下1200 r/min離心5 min，再加入100 μl血紅蛋白溶液混合均勻；重復(fù)上一步驟，最終體積為1.5 ml；將上清轉(zhuǎn)移至另一1.5ml離心管中，15000r/min離心5 min，取上清，備用。

2.2.3 原子吸收法測定用樣品的消化 取樣品供試液1 ml于聚四氟乙烯燒杯中，加3 ml硝酸和2 ml水，在電熱板上加熱至90～95℃。加熱至供試液近干時，取下，放冷，再加入3 ml硝酸，加蓋于95℃加熱回流，必要時繼續(xù)加硝酸，至消解完全（消解液透亮，回流顏色不再發(fā)生變化），繼續(xù)加熱至近干，然后用熱2.5%硝酸溶液洗滌燒杯壁，溶解沉淀和殘渣并轉(zhuǎn)移至10 ml棕色量瓶中，最后用2.5%硝酸溶液定容。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.3.1 儀器工作條件 按照J(rèn)ENA novAA400原子吸收光譜儀的使用說明書，調(diào)節(jié)儀器至最佳工作狀態(tài)。按儀器操作規(guī)程測定待測液的質(zhì)量濃度和吸光度。原子吸收光譜儀工作條件見表2。

表2 原子吸收光譜儀工作條件Tab 2 Working conditions of atomic absorption spectrometer

2.3.2 Ag標(biāo)準(zhǔn)溶液的原子吸收工作曲線 將Ag標(biāo)準(zhǔn)貯備液逐級稀釋成0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，測量吸光度。以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.001310+0.198979 x（r＝0.9994），特征質(zhì)量濃度為0.02191 mg/L。結(jié)果表明，Ag的質(zhì)量濃度在0～1.10 mg/L范圍內(nèi)與其吸光度呈良好線性關(guān)系。Ag標(biāo)準(zhǔn)溶液的原子吸收工作曲線見圖1。

圖1 Ag標(biāo)準(zhǔn)溶液的原子吸收工作曲線Fig 1 Atomic absorption curves of standardAg solution

2.3.3 精密度試驗 精密吸取質(zhì)量濃度為0.4 mg/L的Ag標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行10次平行測定，測得平均值為0.4006 mg/L，RSD＝0.494%（n＝10），表明方法精密度良好。

2.3.4 加樣回收率試驗 在樣品中加入Ag標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收率測定，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝10）Tab 3 Results of recovery tests（n＝10）

3 結(jié)果

MTs含量與Ag的質(zhì)量濃度在最終上清液中成正比，按照MTs與Ag的結(jié)合方式，可以推算出最終MTs的含量。張保林等[7]運(yùn)用該方法對博霖飲品中MTs含量進(jìn)行測定，研究表明銀飽和分析法對測量MTs具有很高的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。該法推算原理如下[8]:理論上每分子MTs可以結(jié)合20個Ag+，但研究中往往實際結(jié)合量偏低，這是由于氧化造成分子間和分子內(nèi)形成了二硫鍵。對兔肝Zn MTs或Cd MTs結(jié)合Ag+的研究表明，1 mol MTs的蛋白飽和量為17～18 mol Ag+，1 μg Ag+結(jié)合3.55 μg MTs。因此，樣品中MTs的含量計算公式為:

式中，cAg+為最終上清液中Ag+的質(zhì)量濃度；cBKG為空白樣品最終上清液中的讀數(shù)；VT和SV分別為最終總體積和加入樣品液體積。

本研究用甘氨酸溶液制備成Ag+濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 ppm的標(biāo)準(zhǔn)液，以原子吸收法測定吸光度，得到Ag標(biāo)準(zhǔn)曲線；MTs質(zhì)量濃度對應(yīng)Ag吸光度在一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系，最適測量范圍為5～20 μg/ml。樣品MTs含量＝5.65×102 A（Ag），相關(guān)系數(shù)f＝0.999。式中，A為吸光度，在MTs質(zhì)量濃度大于20 μg/ml時需先進(jìn)行適當(dāng)稀釋。樣品中MTs含量見表4。

表4 樣品中MTs含量（n＝5）Tab 4 Contents of MTs in samples（n＝5）

使用SPSS16.0統(tǒng)計軟件對不同組別數(shù)據(jù)按照α＝0.01水平進(jìn)行t檢驗。結(jié)果表明，同一重金屬不同濃度間誘導(dǎo)MTs無統(tǒng)計學(xué)差異；對于同一重金屬不同部位的誘導(dǎo)，Cu誘導(dǎo)的肌肉和內(nèi)臟中的MTs濃度無統(tǒng)計學(xué)差異，而Cd、Zn、Pb組別均有統(tǒng)計學(xué)差異，表現(xiàn)為Cd和Pb誘導(dǎo)的MTs在內(nèi)臟中表達(dá)較多，而Zn誘導(dǎo)的MTs則主要在肌肉中表達(dá)較多。

4 討論

研究表明，重金屬在蚯蚓體內(nèi)的分布主要有兩種方式:通過表皮的被動擴(kuò)散與腸道的主動蓄積；對于主動蓄積的重金屬，其主要蓄積部位集中在腸道、腎管和前列腺而不在肌肉和體壁[9]。蚯蚓體內(nèi)本身存在低水平的MTs，在經(jīng)過重金屬的誘導(dǎo)后能夠產(chǎn)生大量的MTs表達(dá)。因此，采用本研究方法，根據(jù)MTs含量在蚯蚓體內(nèi)的分布，可推測重金屬在蚯蚓體內(nèi)的代謝軌跡。

本研究中，Cd、Pb誘導(dǎo)的MTs量在內(nèi)臟中均明顯較肌肉中多，顯示參環(huán)毛蚓對Cd、Pb具有主動蓄積的效應(yīng)。其中，Cd的誘導(dǎo)濃度遠(yuǎn)低于其他金屬，但誘導(dǎo)的MTS總量與其他金屬誘導(dǎo)總量相近，可見Cd對MTs的誘導(dǎo)能力最強(qiáng)。本實驗按照國家土壤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所設(shè)置的Cd高、中、低濃度之間誘導(dǎo)的MTs量差別不大，在這種情況下，蚯蚓本身個體差異因素可能會造成低濃度蓄積量高于高濃度的情況。而Cu在肌肉與內(nèi)臟中誘導(dǎo)的MTs量相近，表明Cu在蚯蚓體內(nèi)的分布呈均勻狀態(tài)，其主動蓄積的能力并不明顯。而對于Zn，蚯蚓具有明顯的體內(nèi)代謝作用。

本研究結(jié)果也表明，在國家土壤標(biāo)準(zhǔn)這一較低濃度重金屬環(huán)境下，參環(huán)毛蚓受同一金屬不同濃度誘導(dǎo)，其MTs表達(dá)差異并不明顯，而且Cd、Pb和Zn之間的誘導(dǎo)能力差異也不明顯。因此，在考察參環(huán)毛蚓MTs受重金屬誘導(dǎo)的應(yīng)激特性時，應(yīng)首先摸索參環(huán)毛蚓在不同重金屬中的長期最高耐受濃度，以此為基準(zhǔn)，設(shè)立對數(shù)級別差異的濃度差，以考察其MTs表達(dá)量的差異。

銀飽和分析法是基于Ag與MTs的高親合力及MTs的對熱穩(wěn)定性，通過原子吸收法測定與MTs結(jié)合的Ag+含量，從而推算出MTs含量的方法。Ag對MTs的結(jié)合能力遠(yuǎn)高于一般金屬，且該方法對不同的金屬離子不具有偏向性，因此能用于經(jīng)不同重金屬誘導(dǎo)的MTs的準(zhǔn)確定量。研究顯示，銀飽和分析法可用于測定含量范圍較廣的MTs，尤其適合于測定低質(zhì)量濃度的MTs，最低限為1μg/ml[10]。本研究建立的銀飽和分析法，不需要預(yù)先將MTs從樣品中分離純化，不需要特殊的儀器，不易受樣品及操作中O2的影響，可以對樣品中的MTs直接測定，具有簡便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點。

[1]李薇，肖翔林，吳文如.藥用動物重金屬富集作用的利與弊[J].中國藥房，2007，18（12）:954.

[2]李薇，沈克，楊潔瑜，等.廣地龍對重金屬富集特性的初步研究[J].中藥材，2007，30（5）:519.

[3]Wimmer U，Wang Y，Georgiev O.Two major branches of anti-cadmium defense in the mouse:MTF-1/metallothioneins and glutathione[J].Nucleic Acids Res，2005，33（18）:5715.

[4]JE Morgan，AJ Morgan.The accumulation of metals（Cd，Cu，Pb，Zn and Ca）by two ecologically contrasting earthworm species（Lumbricus rubellus and Aporrectodea caliginosa）:implications for ecotoxicological testing[J].Applied Soil Ecolo，1999，13（1）:9.

[5]王達(dá)，葛剛，吳蘭，等.金屬硫蛋白（MTs）的分離純化與檢測技術(shù)[J].江西科學(xué)，2004，22（1）:61.

[6]OECD.OECD guidelines for the testing of chemicals[S].1998:207.

[7]張保林，盛湘蓉，劉興軍，等.金屬硫蛋白測定方法——銀飽和分析法[J].藥物生物技術(shù)，1996，3（1）:31.

[8]Abelson JN，Simon MI.Methods in Enzymology[M].New York:Academic Press，1991:205.

[9]Morgan AJ，Sturzenbaum SR，Winters C，et al.Differential metallothionein expression in earthworm（Lumbricus rubellus）tissues[J].Ecotoxicol Environ Saf，2004，57（1）:11.

[10]田曉麗，郭軍華.金屬硫蛋白的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊，2005，3（2）:119.