苗君蒞，于 鵬，肖 楊，任 璐，蔡 濤，王 輝

（光明乳業(yè)研究院（乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室），上海200436）

人體血液中膽固醇含量的增加與冠心病發(fā)病率的升高密切相關(guān)，過多膽固醇的堆積會導(dǎo)致多種心血管疾病[1]。雖然目前市面上有許多降低膽固醇的藥物，但人們希望從飲食做起、通過非藥物途徑達到降低膽固醇的目的。

人體每天膽固醇的攝入量上限值為300mg（相當(dāng)于一個雞蛋黃的膽固醇含量），對于高膽固醇患者而言，每日攝入膽固醇含量不宜超過200mg。牛奶（按脂肪含量3.2g/100g計）中的膽固醇含量約為15mg/100g[2]，如果每人每天喝250g牛奶，膽固醇的攝入量已占最高值的近20%。而脫脂牛奶雖然隨著脂肪的去除，基本不含有膽固醇，但存在的風(fēng)味缺陷，是眾多消費者不愿接受的。因此，在不損失口味的前提下，生產(chǎn)一款真正的低膽固醇牛奶，意義重大。

目前國內(nèi)外有關(guān)降低食品中膽固醇含量的報道，多為采用超臨界萃取法[3]、（接枝）β-環(huán)糊精法[4-5]、膽固醇氧化酶法[6]等來降低豬油、蛋黃、乳脂肪等動物性食品中的膽固醇含量，膽固醇脫除率均在80%左右，且β-環(huán)糊精殘留量較高。而對于降低牛乳中的膽固醇卻沒有報道。本文采用食用級β-環(huán)糊精降低牛奶中的膽固醇，其成本低廉，膽固醇去除率高，β-環(huán)糊精脫除后殘留量極低。因此，為低膽固醇牛奶的問世奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

生牛乳（膽固醇含量15～18mg/100g） 光明乳業(yè)；食用級β-環(huán)糊精 欣榮貿(mào)易；無水乙醚、石油醚（沸程30～60℃）、硫酸鐵二銨、冰醋酸、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸銅、次甲基藍、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀 均為分析純，國藥化學(xué)。

ND-2000C NanoDrop型微量分光光度計 美國Thermo Fisher Scientific公司；C32M020279D型離心機

美國熱電Thermo；SY0201型高效液相色譜儀 日本島津；HH-60型恒溫烘箱 常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 低膽固醇牛奶的制備 牛奶均質(zhì)后加入β-環(huán)糊精，保溫攪拌一段時間，離心去除β-環(huán)糊精[7]，牛奶升溫、均質(zhì)、殺菌、灌裝。

1.2.2 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)GB/T 5009.128-2003[8]方法，繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 牛奶中膽固醇含量的測定 根據(jù)GB/T 22220-2008[9]和GB/T 5009.128-2003[8]測定牛奶中膽固醇含量。

1.2.4 膽固醇脫除率 計算公式如下：

膽固醇脫除率（%）=（牛奶中原膽固醇含量-脫除后牛奶中膽固醇含量）/牛奶中原膽固醇含量×100

其中，脫除后牛奶中膽固醇含量由GB/T 5009.128-2003測定。

1.2.5 β-環(huán)糊精殘留量測定 參照分光光度計法測定β-環(huán)糊精殘留量[10]。

1.2.6 反應(yīng)溫度對牛奶中膽固醇脫除率的影響 在100g牛奶中加入1%（w/w）的β-環(huán)糊精，分別于30、45、60、75℃下保溫攪拌15min，8000r/min離心20min，測定牛奶的膽固醇脫除率。

1.2.7 攪拌時間對牛奶中膽固醇脫除率的影響 在100g牛奶中加入1%（w/w）的β-環(huán)糊精，在60℃下分別攪拌15、30、45、60、75min，8000r/min離心20min，測定牛奶的膽固醇脫除率。

1.2.8 離心轉(zhuǎn)速對牛奶中膽固醇脫除率的影響 在100g牛奶中加入1%（w/w）的β-環(huán)糊精，在60℃下保溫攪拌60min，分別在4000、6000、8000、10000r/min的條件下離心20min，測定牛奶的膽固醇脫除率。

1.2.9 β-環(huán)糊精添加量對牛奶中膽固醇脫除率的影響 分別加入1%、2%、3%、4%（w/w）的β-環(huán)糊精至100g牛奶中，60℃下保溫攪拌60min，10000r/min離心20min，測定牛奶的膽固醇脫除率。

1.2.10 脫除膽固醇的工藝條件優(yōu)化 上述單因素的實驗的基礎(chǔ)上，按三因素二次回歸正交組合設(shè)計對脫除膽固醇的工藝條件進行優(yōu)化，優(yōu)化的因素水平表如表1所示，進而得出最優(yōu)方案，用SAS軟件對結(jié)構(gòu)進行統(tǒng)計分析。

表1 響應(yīng)面分析因素水平表Table 1 Analytical factors and levels for RSA

2 結(jié)果與討論

食用級β-環(huán)糊精是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶作用于淀粉的產(chǎn)物，由7個α-（1，4）糖苷鍵鏈接成環(huán)形的結(jié)構(gòu)。β-環(huán)糊精具有一個外環(huán)親水、內(nèi)環(huán)疏水且有一定尺寸的立體手性空腔，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)和空腔可以包絡(luò)不同的化合物。包合物的形成受到時間、反應(yīng)溫度、攪拌（或超聲振蕩）時間、反應(yīng)物濃度等外在條件的影響[11]。

2.1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)GB/T 5009.128-2003，得到的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.2 反應(yīng)溫度對牛奶中膽固醇脫除率的影響

由圖2可見，在45～60℃的反應(yīng)溫度下，牛奶中膽固醇脫除率隨反應(yīng)溫度的上升而增加，當(dāng)溫度超過60℃時，脫除率逐漸下降。這也許由于溫度過高時，脂肪的聚集速度迅速增加，致使β-環(huán)糊精與脂肪的接觸幾率減少，從而導(dǎo)致包合脫除率降低。

2.3 攪拌時間對牛奶中膽固醇脫除率的影響

由圖3可見，膽固醇脫除率隨攪拌時間的增加而上升。當(dāng)攪拌時間達到60min時，膽固醇脫除率超過95%，說明充分包合膽固醇需要一定的時間。但當(dāng)時間無限延長時，由于攪拌剪切作用，使得β-環(huán)糊精結(jié)構(gòu)受到一定破壞，膽固醇再次釋放出來，從而脫除率有所下降。

圖1 膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard sorption curve of cholesterol

圖2 反應(yīng)溫度對膽固醇脫除率的影響Fig.2 Influence of temperature on the cholesterol removal rate

圖3 攪拌時間對膽固醇脫除率的影響Fig.3 Influence of mixing time on the cholesterol removal rate

2.4 離心轉(zhuǎn)速對牛奶中膽固醇脫除率的影響

離心操作使β-環(huán)糊精沉降的同時，促進了對膽固醇的包合，因此，如圖4所示，當(dāng)離心速率6000～10000r/min時，膽固醇脫除率逐步升高，當(dāng)轉(zhuǎn)速為10000r/min時，膽固醇脫除率達到97.4%，之后便趨于平穩(wěn)。

2.5 β-環(huán)糊精添加量對牛奶中膽固醇脫除率的影響

由圖5可見，當(dāng)β-環(huán)糊精添加量在1%～2%時，膽固醇脫除率有所增加，從97.4%上升至99%；當(dāng)添加量大于2%時，脫除率幾乎沒有變化，但總體差異不大。因此，基于β-環(huán)糊精殘留量及成本的考慮，β-環(huán)糊精添加量2%為宜。

2.6 脫除膽固醇的工藝條件優(yōu)化

圖4 離心轉(zhuǎn)速對膽固醇脫除率的影響Fig.4 Influence of centrifugation rate on the cholesterol removal rate

圖5 β-環(huán)糊精添加量對膽固醇脫除率的影響Fig.5 Influence of β-CD dosage on the cholesterol removal rate

從上述單因素實驗結(jié)果可以看出，反應(yīng)溫度、攪拌時間、離心轉(zhuǎn)速對于脫除牛奶中膽固醇具有較大的影響，而β-環(huán)糊精添加量影響不大。按照響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計，優(yōu)化實驗結(jié)果如表2所示。

2.6.1 三因素二次旋轉(zhuǎn)回歸分析 經(jīng)回歸擬合后，膽固醇脫除率對響應(yīng)值的影響可用以下函數(shù)表示：Y=98.86-1.30A-1.24B+1.11C-0.73AB+0.38AC+0.65BC-11.91A2-3.93B2+0.972

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果Table 2 Program and experimental results of RSA

其響應(yīng)面二次模型方差分析表見表3。

表3 響應(yīng)面方差分析表Table 3 Results of variance analysis

由表3可見，方程具有顯著性，可用此方程分析反應(yīng)溫度、攪拌時間、離心轉(zhuǎn)速對于膽固醇脫除率的影響。回歸模型的R2=0.9864，說明模型的擬合度較好，響應(yīng)值的98.64是由所選變量引起，采用F檢驗方法對模型的顯著性進行分析。F值為56.46，p值＜0.0001，模型相當(dāng)顯著。由表3的分析結(jié)果可知，各因素對膽固醇脫除率影響的大小順序為：A＞B＞C，說明反應(yīng)溫度對于膽固醇脫除率的影響最為明顯，其次為攪拌時間，最后是離心轉(zhuǎn)速，而三因素之間的交互作用影響并不顯著。

2.6.2 反應(yīng)溫度、攪拌時間、離心轉(zhuǎn)速單因子及交互作用對膽固醇脫除率的影響 通過方程可以得出反應(yīng)溫度、攪拌時間、離心轉(zhuǎn)速單因子及其交互作用對膽固醇脫除率的影響圖（見圖6～圖8）。

圖6 反應(yīng)溫度和攪拌時間的響應(yīng)面圖Fig.6 Responsive surfaces of temperature and mixing time

當(dāng)離心轉(zhuǎn)速一定時，膽固醇脫除率與反應(yīng)溫度－攪拌時間呈二次曲線相關(guān)的關(guān)系。由圖6可見，膽固醇脫除率隨反應(yīng)溫度的升高而升高，其增加趨勢十分明顯。60℃時達到最高點，當(dāng)溫度超過60℃時，膽固醇脫除率隨之下降。膽固醇脫除率隨攪拌時間的增加而升高，攪拌時間到達60min時，膽固醇脫除率最高，攪拌時間越長，脫除率也會受影響而隨之下降。此結(jié)果與單因素實驗相符，說明反應(yīng)溫度和攪拌時間都有最高點，只有適當(dāng)條件的配合下，才能使脫除率達到最高。

圖7 反應(yīng)溫度和離心轉(zhuǎn)速的響應(yīng)面圖Fig.7 Responsive surfaces of temperature and centrifugation rate

當(dāng)攪拌時間一定時，膽固醇脫除率與反應(yīng)溫度－離心轉(zhuǎn)速呈二次曲線相關(guān)的關(guān)系。如圖7所示，膽固醇脫除率隨反應(yīng)溫度的升高而升高，60℃達到最大值，當(dāng)溫度大于60℃時，膽固醇脫除率開始下降。膽固醇脫除率隨離心轉(zhuǎn)速的加大而逐漸升高。離心轉(zhuǎn)速達到10000r/min時，脫除率超過95%。

圖8 攪拌時間和離心轉(zhuǎn)速的響應(yīng)面圖Fig.8 Responsive surfaces of mixing time and centrifugation rate

當(dāng)反應(yīng)溫度一定時，膽固醇脫除率與攪拌時間－離心轉(zhuǎn)速呈二次曲線相關(guān)的關(guān)系。如圖8所示，膽固醇脫除率隨離心轉(zhuǎn)速的升高而逐漸升高；膽固醇脫除率隨攪拌時間的增加而升高，攪拌時間到達60min時，膽固醇脫除率最高，攪拌時間繼續(xù)增加，脫除率也會受影響而隨之下降。

2.6.3 優(yōu)化設(shè)計結(jié)果 通過響應(yīng)面優(yōu)化實驗，采用SAS系統(tǒng)計算進行聯(lián)合求解，得到的優(yōu)化條件為：反應(yīng)溫度59.63℃，反應(yīng)時間58.94min，離心轉(zhuǎn)速12000r/min，β-環(huán)糊精添加量2%。考慮實際操作性，修正條件為：反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間60min，離心轉(zhuǎn)速12000r/min；此條件下制得的牛奶膽固醇脫除率預(yù)測值為98.854%，經(jīng)實驗后實測值為99.10%。

2.7 牛奶中膽固醇含量的測定

根據(jù)工藝優(yōu)化結(jié)果，制得的低膽固醇牛奶，參照GB/T 22220-2008（最低檢出限為2.6mg/100g），對其中的膽固醇含量進行測定。其色譜圖和測定結(jié)果如下：

圖9 膽固醇標(biāo)樣圖譜Fig.9 Chromatograms of cholesterol standards

圖10 樣品峰值圖Fig.10 Chromatograms of sample

以上結(jié)果說明，當(dāng)β-環(huán)糊精法與牛奶在60℃下攪拌反應(yīng)60min后，12000r/min離心脫除β-環(huán)糊精，牛奶中的膽固醇含量位于檢出限以下。由此可見，通過β-環(huán)糊精法降低牛奶中的膽固醇含量效果明顯。

2.8 β-環(huán)糊精殘留量的測定

將2%的β-環(huán)糊精加入牛奶中，以上述優(yōu)化工藝對牛奶中的膽固醇進行脫除，反應(yīng)完畢后12000r/min離心脫除，測得的β-環(huán)糊精殘留量為2.2%。此殘留量遠(yuǎn)低于之前報道[12]中采用β-環(huán)糊精脫除食品中膽固醇的β-環(huán)糊精殘留。

3 結(jié)論

本實驗將β-環(huán)糊精直接加入牛奶中，對膽固醇進行脫除。分別研究了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、離心轉(zhuǎn)速、β-環(huán)糊精添加量對膽固醇脫除率的影響，并在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合的實驗設(shè)計，得到最佳的工藝條件為：反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間60min，離心轉(zhuǎn)速12000r/min，β-環(huán)糊精添加量2%。在此條件下制得的牛奶膽固醇脫除率達到98%以上，且在檢測限以下，β-環(huán)糊精殘留量2.2%。此研究為低膽固醇牛奶的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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