蔣錫龍，孫玉霞，董興全，魏彥鋒，史紅梅，李彥奎，張晶瑩

(山東省釀酒葡萄科學(xué)研究所，山東濟(jì)南250100)

香氣是葡萄酒、果酒品質(zhì)的最重要特征之一，代表了幾百種揮發(fā)性物質(zhì)復(fù)雜的平衡［1－2］。葡萄酒和果酒的一類香氣或品種香氣，主要是萜烯類化合物和C13－降異戊二烯衍生物，是由釀酒使用的原料品種及其產(chǎn)地決定。但更多的香氣物質(zhì)即二類或者發(fā)酵香氣，是在乙醇發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生。二類香氣物質(zhì)的產(chǎn)量與所用酵母密切相關(guān)，主要包括高級(jí)醇、酯、脂肪酸、羰基化合物和揮發(fā)性酚類等［3－5］。果酒是新鮮水果發(fā)酵而來(lái)的一種乙醇飲料，近年來(lái)，已有研究者對(duì)適宜釀酒的水果如蘋(píng)果，香蕉，芒果，可可等進(jìn)行了果酒釀造研究［6］，而桃果酒釀造及香氣成分研究尚無(wú)報(bào)道。桃果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，且富含風(fēng)味物質(zhì)，目前從桃果實(shí)中已分離到近百種香氣成分，主要包括醇類、酯類、醛類、酮類、內(nèi)酯類、烴類和其他類型化合物等［7］。葡萄酒、果酒香氣是一個(gè)復(fù)雜的內(nèi)部反應(yīng)，在無(wú)數(shù)揮發(fā)性化合物以及這些化合物之間通過(guò)各種方式相互反應(yīng)，從而形成酒最終的香氣和風(fēng)味［8］。近年來(lái)，隨著“分析技術(shù)和設(shè)備的發(fā)展，香氣物質(zhì)的分析已從最初的集中分析主要揮發(fā)性化合物，提高到能夠分析含量很低(甚至低于ng·L－1)但氣味閾值很低的揮發(fā)性化合物”［9］。本實(shí)驗(yàn)桃果酒由5種不同釀酒酵母釀造，固相微萃取(Solid－Phase Micro－Extraction，SPME)技術(shù)萃取桃果酒中揮發(fā)性化合物，氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用(GC－MS)分析其揮發(fā)性成分，分析5種桃果酒中醇、酯、酸、羰基化合物、揮發(fā)性酚類以及萜烯類化合物的組成與含量，研究不同酵母對(duì)桃果酒香氣的影響，篩選適合桃果酒釀造的酵母。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濟(jì)南本地“大久?！碧覟樵?，成熟桃去皮榨汁，添加白砂糖至糖度為22°Bx，分成5份，加入等量釀酒酵母，相同條件下發(fā)酵(溫度:22℃，SO2濃度:80mg·L－1)。5 種釀造酵母為 J11、DV10、Ec1118、D21、K1，其中J11為本實(shí)驗(yàn)室自濟(jì)南郊區(qū)桃園野生酵母選育出，經(jīng)26S rDNA D1/D2區(qū)鑒定為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，其余均為法國(guó)拉曼(LALLEMAND)商品活性干酵母。桃酒釀造年份為2011年8月。2011年10月對(duì)桃果酒香氣成分進(jìn)行了測(cè)定。

表1 不同釀酒酵母發(fā)酵桃果酒的理化指標(biāo)Table 1 Physiochemical characteristics of wines fermented by different S.cerevisiae strains

表2 桃果酒醇類化合物含量Table 2 The contents of alcohols in the peach fruit wines

手動(dòng)SPME進(jìn)樣器 Supelco公司，美國(guó);GC－2010/QP 2010 Plus氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀Shimadzu公司，日本;2－辛醇 99.99%(內(nèi)標(biāo))Sigma公司，美國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桃果酒理化指標(biāo)的測(cè)定方法 酒精蒸餾后用酒精計(jì)測(cè)定，殘還原糖用斐林法測(cè)定，揮發(fā)酸、總酸以指示劑法滴定。

1.2.2 固相微萃取(Solid－Phase Micro－Extraction，SPME)操作 SPME頂空萃取:選取8mL桃酒樣放入15mL樣品萃取瓶中，加入1.5g氯化鈉，內(nèi)標(biāo)2－辛醇及磁力轉(zhuǎn)子置于固相微萃取工作臺(tái)上45℃預(yù)熱10min;將固相微萃取器的萃取頭50/30μm DVB/CAR/PDMS(Supelco，USA)通過(guò)瓶蓋聚四氟乙烯隔墊插入樣品萃取瓶的頂空，推出吸附頭使其暴露于萃取瓶頂空蒸汽中進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間50min，萃取溫度45℃。當(dāng)樣品萃取平衡后，縮回纖維頭，迅速將針管插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口，推出纖維頭熱解析10min，同時(shí)啟動(dòng)氣相色譜儀采集數(shù)據(jù)。

1.2.3 GC－MS分析條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱:Stabilwax－DA毛細(xì)管柱(30m×0.32mm ×0.25μm，Restek公司，美國(guó));升溫程序:30℃ 保持 1min，以 6℃/min升至 100℃，以3℃/min升溫至200℃，以10℃/min升溫至210℃，保持3min;進(jìn)樣器溫度250℃;檢測(cè)器溫度250℃，無(wú)分流進(jìn)樣。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源;電子能量70eV;離子源溫度200℃;全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍:30～400u。通過(guò)計(jì)算機(jī)檢索與NIST08和WILEY7質(zhì)譜庫(kù)提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對(duì)照進(jìn)行確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

供試酒樣常規(guī)理化分析見(jiàn)表1。

2.1 揮發(fā)性醇類化合物分析

醇主要是酵母代謝產(chǎn)生的次級(jí)產(chǎn)物［5，8］。分析的5種桃果酒，被檢出的醇共有16種(見(jiàn)表2)，其中J11含有15種，種類最多，D21種類最少，為13種。醇的總量DV10最高，Ec1118次之，D21最低。異戊醇、異丁醇、丙醇、β－苯乙醇、苯甲醇以及十二烷醇為5種桃果酒中主要的醇類。

表3 桃果酒酸類化合物含量Table 3 The contents of acids in the peach fruit wines

在檢測(cè)出的醇中，異戊醇(果香，酒香［9］)含量最高，而且5種桃果酒中含量相近，是最主要的組分。異丁醇(果香，酒香)主要由纈氨酸代謝產(chǎn)生［8］，在J11中最高，Ec1118中最低。丙醇在酵母代謝中由丙酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，在Ec1118中含量最高，在J11中最低。十二烷醇(花香)含量在J11中最高。

芳香醇嗅覺(jué)閾值一般都很低，因此其在酒的總體香氣形成中具有不可忽視的作用，β－苯乙醇(玫瑰香氣，蜂蜜香氣［9］)由酵母利用糖或氨基酸合成，是最重要的苯來(lái)源的高級(jí)醇［5］，在5種桃果酒中J11含量最高，K1中含量最低。苯甲醇(微弱芳香)含量DV10中最高。

在5種酒中都被檢測(cè)出的醇還有正丁醇、2，3－丁二醇、正辛醇、正癸醇以及順式－3－己烯－1－醇以及2－乙基－1－己醇，含量從每升幾微克到幾十微克不等。

2.2 揮發(fā)性酸類化合物分析

脂肪酸是酵母代謝的次級(jí)產(chǎn)物［5］。5種桃果酒中共檢測(cè)出9種酸(見(jiàn)表3)，其中DV10中含有9種，J11、Ec1118和D21含有8種，K1中最少為6種?？偹岷縅11最多，K1最少。乙酸、辛酸和癸酸是檢測(cè)出酸的主要種類，其中辛酸的含量最高。

2.3 酯類化合物比較分析

揮發(fā)性酯是組成香氣化合物的最重要種類，它們賦予葡萄酒和其他發(fā)酵飲料主要的水果香氣［10］。在酵母代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)中，酯對(duì)酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)最大［9］。在5種桃果酒中共檢測(cè)出44種酯類(見(jiàn)表4)，脂肪酸乙酯和高級(jí)醇的乙酸酯是其主要種類。其中辛酸乙酯(花香、果香)含量最高，癸酸乙酯(椰子香氣)和9－癸烯酸乙酯的含量也較高。乙酸乙酯(菠蘿香氣)、乙酸異戊酯(香蕉香氣)、己酸乙酯(菠蘿、香蕉香氣)、乙酸己酯(梨和蘋(píng)果香氣)、甲酸己酯(蘋(píng)果香氣)、苯甲酸乙酯(冬青油、果香)以及乙酸苯乙酯(蜜香、花香)對(duì)桃果酒的香氣也有較大貢獻(xiàn)。γ－癸內(nèi)酯是桃果實(shí)中特有的芳香物質(zhì)［11－12］，在 5 種桃果酒中都有檢出。5種桃果酒的酯總量差別明顯，最高的 J11 為 10950.20μg·L－1，最低的 K1 只有6984.46μg·L－1。

2.4 羰基化合物比較分析

在5種桃果酒中共檢測(cè)出14種揮發(fā)性羰基化合物(見(jiàn)表5)，苯甲醛是J11中含量最高的羰基化合物，在其他4種酒中乙醛的含量最高。乙偶姻在5種桃果酒中都有較高的含量。

在葡萄酒和發(fā)酵飲料中，乙醛(果香)約占到總?cè)┑?0%，對(duì)酒的香氣起著重要作用［13］。同時(shí)，乙醛也是乙酸、乙偶姻和乙醇的合成前體，低含量的乙醛能賦予葡萄酒和發(fā)酵飲料愉悅的水果香氣，但含量高時(shí)會(huì)產(chǎn)生青草或青蘋(píng)果的辛辣刺激味道［5，14－15］。5種桃果酒中，乙醛含量在250～320μg·L－1之間。乙偶姻(奶油香氣)有很強(qiáng)的氣味，是乙醇發(fā)酵中產(chǎn)生的普通產(chǎn)物，在發(fā)酵飲料中有不同的來(lái)源:添加的乙醇發(fā)酵酵母，水果果皮附帶的野生酵母以及蘋(píng)乳發(fā)酵的細(xì)菌都能產(chǎn)生乙偶姻［16］。

苯甲醛(苦杏仁香氣)是桃果實(shí)中富含的揮發(fā)性香氣物質(zhì)之一［17］，在5種桃果酒中含量差距很大，J11最高為 387.98μg·L－1，最低的 K1 只有 36.28μg·L－1。同時(shí)，苯甲醛含量的差距也造成了5種酒的羰基類化合物總量的差距。5種桃果酒中都檢測(cè)出了壬醛、糠醛以及癸醛。2，3－丁二酮只在 J11和 D21中存在。

2.5 苯系化合物比較分析

5種桃果酒中共檢測(cè)出6種苯系化合物(見(jiàn)表6)，含量都比較低，丁基羥基甲苯含量最高，在31.97～113.02μg·L－1之間。苯系化合物總的含量也不高，最高的 J11 只為 132.75μg·L－1。

2.6 萜類化合物比較分析

萜類化合物是一類天然的烴類化合物，其分子中具有5個(gè)碳的基本單位，多具有不飽和鍵，其結(jié)構(gòu)的基本骨架大都符合(C5H8)的通式。萜類化合物作為香氣物質(zhì)的主要是具有揮發(fā)性的游離型單萜和倍半萜，對(duì)香氣有重要影響的主要有芳樟醇、香葉醇、香茅醇、橙花醇、脫氫芳樟醇、α－松油醇等［18］。在5種桃果酒中，檢測(cè)出11種萜類化合物(見(jiàn)表7)，其中主要的化合物有芳樟醇(鈴蘭香氣)、β－香茅醇(玫瑰香氣)、順式香葉基丙酮(果香、木香、青香)以及二氫－β－紫羅蘭醇(強(qiáng)烈覆盆子和紫羅蘭香氣)。另外檢出的萜類化合物還有乙酸芳樟酯(花香、果香)、脫氫芳樟醇(花香香氣、果香、木香)、橙花叔醇(玫瑰香氣)、金合歡醇(鈴蘭花香氣、青香、木香)等。萜類化合物總量J11最高，K1最低。

表4 桃果酒酯類化合物含量Table 4 The contents of esters in the peach fruit wines

表5 桃果酒羰基化合物含量Table 5 The contents of carbonyl compounds in the peach fruit wines

表6 桃果酒苯系化合物含量Table 6 The contents of bencenic compounds in the peach fruit wines

表7 桃果酒萜烯類化合物含量Table 7 The contents of terpenic compounds in the peach fruit wines

2.7 不同桃酒中各類香氣物質(zhì)含量的比較

5種桃果酒中各類揮發(fā)性化合物含量及所有揮發(fā)性化合物總量的柱狀圖見(jiàn)圖1，酯類是五種桃果酒中含量最多的揮發(fā)性化合物，約占總量的65%～70%。醇類是第二大類揮發(fā)性化合物，揮發(fā)性酯類和醇類物質(zhì)是揮發(fā)性香氣物質(zhì)的主要種類。酚類和萜類物質(zhì)在揮發(fā)性化合物總量中占的比例很小。由圖1可以看出，5種桃果酒中，選育酵母J11釀造的桃果酒揮發(fā)性化合物總量明顯高于4中商品酵母，主要表現(xiàn)在其酯類物質(zhì)含量明顯高于其他4種酵母。

圖1 桃果酒中各類香氣物質(zhì)含量Fig.1 The contents of different aroma substances in 5 peach fruit wines

3 結(jié)論

SPME/GC－MS技術(shù)能夠完成不同物質(zhì)種類中不同組分的的定性和定量，而且可以進(jìn)行復(fù)雜混合物中低含量組分的測(cè)定［9］，因此采用該技術(shù)能夠檢更多測(cè)出低含量的揮發(fā)性化合物。本實(shí)驗(yàn)采用SPME/GC－MS技術(shù)對(duì)桃果酒進(jìn)行分析，5種酒共檢測(cè)出100種揮發(fā)性化合物，其中最多的是J11，檢測(cè)出87種，最少的是K1，檢測(cè)出77種。

在檢測(cè)出的揮發(fā)性化合物中，酯類的種類最多為44種，總含量也最高，在J11中，酯類的含量可以占到揮發(fā)性化合物總量的69.7%，因此酯是桃果酒最重要的香氣成分。醇類不論是檢測(cè)出的種類數(shù)還是物質(zhì)含量，都是第二大類揮發(fā)性化合物。醇和酯組成了桃果酒中揮發(fā)性化合物的主要種類，其他揮發(fā)性化合物如酸、羰基化合物、酚和萜類等含量都很少。因此，在桃果酒的揮發(fā)性物質(zhì)中，醇和酯是主要的組分，異戊醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯以及9－癸烯酸乙酯是桃果酒的主要香氣物質(zhì)。

萜類物質(zhì)主要表現(xiàn)果實(shí)的品種香氣［12］，5種桃果酒中J11檢測(cè)出的萜類物質(zhì)含量最高。γ－癸內(nèi)酯是桃果實(shí)特有的香氣物質(zhì)，5種桃果酒中都檢測(cè)出該物質(zhì)，含量在 3.2～8.05μg·L－1之間，其中 J11 中含量最高。結(jié)果表明酵母J11釀造桃果酒能更好地保留桃果實(shí)自身的風(fēng)味特征。

通過(guò)檢測(cè)分析，自選酵母J11釀造的桃果酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)的種類、含量上都優(yōu)于其他4種商品酵母，而且J11能更好的體現(xiàn)桃果實(shí)自身的特征，因此可以證明自釀酒選酵母J11更適合桃果酒的釀造。

［1］Carolina M，Juan J R，Victoria M，et al.Beyond the characterization of wine aroma compounds:looking for analytical approaches in trying to understand aroma perception during wine consumption［J］.Anal Bioanal Chem，2011，401:1497－1512.

［2］Ivanova V，Stefova M，Stafilov T，et al.Validation of a method for analysis of aroma compounds in red wine using liquid－Liquid extraction and GC － MS［J］.Food Anal Methods，2012，5:1427－1434.

［3］Vilanova M，Mart′?nez C.First study of determination of aromatic compounds of red wine［J］.Eur Food Res Technol，2007，224:431－436.

［4］Rapp A，Mandery H.Wine aroma［J］.Experientia，1986，42:873－884.

［5］Ivanova V，Stefova M，Vojnoski B，et al.Volatile Composition of Macedonian and Hungarian Wines Assessed by GC/MS［J］.Food Bioprocess Technol，2012，Published online:05 January

［6］Fan Gang，Xu Xiaoyun，Qiao Yu，et al.Volatiles of orange juice and orange wines using spontaneous and inoculated fermentations［J］.Eur Food Res Technol，2009，228:849－856.

［7］Hidenobus S，Sachiko S，Aya N，et al.Changes in composition of volatile compounds in high pressure treated peach［J］.Agric Food Chem，1994，42(3):785－790.

［8］Styger G，Prior B，Bauer F F.Wine flavor and aroma［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2011，38:1145－1159.

［9］Verzera A，Ziino M，Scacco A，et al.Volatile Compound and Sensory Analysis for the Characterization of an Italian White Wine from “Inzolia” Grapes［J］.Food Anal Methods，2008，1:144－151.

［10］Lilly M，Lambrechts M G，Pretorius I S.Effect of increased yeast alcohol acetyltransferase activity on flavor profiles of wine and distillates［J］.Appl Environ Microbiol，2000，66:744－753.

［11］魏好程，湯鳳霞，陳發(fā)河.采后桃果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)研究進(jìn)展［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，25(3):281～285.

［12］胡玲，李麗萍，王友升.桃李果實(shí)風(fēng)味物質(zhì)的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38(7):3707－3709，3711.

［13］Sadineni V，Kondapalli N，Sarathi V，et al.Effect of cofermentation with Saccharomycescerevisiae and Torulaspora delbrueckii or Metschnikowia pulcherrima on the aroma and sensory properties of mango wine［J］.Ann Microbiol，2012，62:1353－1360.

［14］Nykanin L.Formation and occurrence of flavor compounds in wine and distilled alcoholic beverages［J］.Am J Enol Vitic，1986，37:84－96.

［15］Liu S－Q，Pilone G.An overview of formation and roles of acetaldehyde in winemaking with emphasis on microbiological implications［J］.Int J Food Sci Technol，2000，35:49－61.

［16］Romano P，Suzzi G.Origin and production of acetoin during wineyeastfermentation［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62(2):309－315.

［17］Horvat R J，Chapman Vt G W，Robertson Jr J A.Comparison of the volatile compounds from several commercial peach cultivars［J］.J Agric Food Chem，1990，38:234－237.

［18］劉麗媛，劉延琳，李華.葡萄酒香氣化學(xué)研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2011，32(5):310－316.