魯 芳，段 晶，聶迎春，毛青青，呂家根，*

(1.陜西師范大學化學化工學院，陜西西安710062;2.青海師范大學化學系，青海西寧810008)

研究證明［1－2］，足夠強度的超聲波可以產(chǎn)生空化現(xiàn)象，在空化氣泡崩塌的瞬間可以產(chǎn)生高溫、高壓的熱點，并伴隨聲致發(fā)光?？栈a(chǎn)生的這些極端的物理條件和能量足以使 H2O發(fā)生裂解，產(chǎn)生OH·［2－6］。如果溶液中存在化學發(fā)光試劑，如 luminol(魯米諾)、lucigenin(光澤精)等，則與超聲所產(chǎn)生的自由基迅速氧化發(fā)光試劑產(chǎn)生很強的化學發(fā)光，被稱之為聲致化學發(fā)光(sonochemiluminescence，SCL)［7－8］。有關超聲空化產(chǎn)生 OH·和 SCL 已有許多深入的研究［6，9－10］，并且推斷出 SCL 強度與 OH·的量有關。由此可見，超聲可作為一種OH·的生成源，而SCL可作為定量測量水溶液中OH·的有效工具。基于此，SCL法可以實現(xiàn)抗氧化劑清除OH·能力的評價。目前，已有的抗氧化性的研究方法［11－17］，都是通過測量剩余的OH·的量來間接測定抗氧化劑清除OH·的能力。然而，由于OH·的反應活性大，壽命短、存在濃度低，其本身很難單獨穩(wěn)定存在。因此，這些方法也就受到了一定的約束，而SCL具有如下潛在的優(yōu)勢:物試劑的產(chǎn)生OH·可以僅僅對抗氧化劑清除OH·的能力進行評價;能在線、均相產(chǎn)生OH·使整個反應避免混合和擴散過程的影響;聲致化學發(fā)光與OH·的產(chǎn)生同步進行，可以獲得對OH·的直接、靈敏、快速的測定;使用儀器及實際簡單?；诖?，本實驗構建了SCL分析法并應用于抗氧化劑對OH·的清除能力的評價，利用水在聲場作用下產(chǎn)生的OH·，OH·氧化luminol發(fā)出強烈的聲致化學發(fā)光，而抗氧化劑的加入將會猝OH·因而清除聲致化學發(fā)光，通過測量SCL的清除情況可以實現(xiàn)抗氧化劑對OH·清除能力的評價。眾所周知，水果不僅可以提供人體所需的維生素、礦物質(zhì)和纖維素等，而且還含有許多植物抗氧化物質(zhì)，如VC、VE、類黃酮、花色素等，這些物質(zhì)具有較強的抗氧化活性，因此，在最優(yōu)條件下，對柳葉桔、草莓、圣女果、獼猴桃、蘋果、西瓜、油桃、菠蘿、甜瓜、大紅柚、火龍果、贛南臍橙十二種水果在體外模擬生理條件下的OH·清除能力進行了評價。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柳葉桔、草莓、圣女果、獼猴桃、蘋果、西瓜、油桃、菠蘿、甜瓜、大紅柚、火龍果、贛南臍橙 均購自當?shù)爻小?/p>

水果抗氧化劑儲備液 十二種水果取果肉部分，各稱取50.0g于200.0mL二次水中，勻漿5min，減壓過濾，濾液2000 r/min離心5min，收集上層液備用。

Luminol 陜 西師 范 大學 自制;NaCl、KCl、KH2PO4、NaHPO4·12H2O 分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。

(1)0.01 mol/L pH7.4 PBS緩沖液 準確稱取NaCl 0.80g，KCl 0.20g，KH2PO40.20g，Na2HPO4·12H2O 2.90g，二次水溶解并定容于1000mL容量瓶中，充分搖勻備用。

(2)1.0×10－2mol/L luminol儲備液 準確稱取luminol 1.772g，用0.01mol/L NaOH溶解后，二次水定容于1000mL棕色容量瓶中，放置暗處保存，兩周使用。使用時，用pH7.4 PBS緩沖液稀釋至所需濃度實驗用水為二次蒸餾去離子水。

MPI－A型多功能化學發(fā)光/生物發(fā)光分析系統(tǒng)西安瑞邁電子科技有限公司;DH48S－S時間繼電器 上海卓一電子有限公司;超聲發(fā)生器 由商品化儀器改裝，功率為35W;陶瓷電壓片 深圳市安之能電子技術有限公司;多功能食品加工機 香港福爾康有限公司;H－1650高速離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 SCL分析裝置構造

SCL分析裝置如圖1所示。儀器裝置由化學發(fā)光儀、光電倍增光、計算機、時間繼電器、超聲發(fā)生器、聲致發(fā)光池、注射器、廢液管鏈接構成。

圖1 聲致化學發(fā)光分析示意圖Fig.1 Schematic diagram of the SCL system

在光電倍增管暗盒內(nèi)安裝聲致化學發(fā)光池。聲致化學發(fā)光池由一個地部半徑2.5cm，體積15mL的玻璃小瓶加工而成，用砂輪將玻璃瓶底部打磨掉，以環(huán)氧樹脂粘結一相同直徑的陶瓷電壓片，陶瓷電壓片的正負兩極分別通過導線與超聲發(fā)生器連接。玻璃瓶口用橡膠塞蓋住并用環(huán)氧樹脂膠密封，橡膠塞上分別插上三根內(nèi)徑為1mm聚氯乙烯管，其中兩短一長，兩個短管分別用于進樣和保持聲致化學發(fā)光池內(nèi)外氣壓平衡，長度為1cm，長管用于廢液的輸出，為6cm。樣品管和廢液管連接一段硅膠管傳出光電倍增管殼體外，聲致化學發(fā)光池池體周圍包一層錫紙用來減少光的反射，增強聲致化學發(fā)光，留1cm寬的狹縫作為聲致化學發(fā)光的入射縫。一定體積的樣品溶液通過注射器推入到聲致化學發(fā)光池后，打開時間繼電器，時間繼電器按設置好的工作模式循環(huán)開關，當溶液受到超聲輻射時，發(fā)出SCL信號，超聲停止則SCL消失。光電倍增管將接收到的信號轉(zhuǎn)換成電信號輸入計算機，計算機對輸入的信號進行數(shù)據(jù)處理并記錄SCL隨時間的譜圖，根據(jù)譜圖逢高進行定量分析。一次測定結束后，用注射器將池體中的廢液抽出，用超純水清洗3次后，重復以上過程，進行下一次測定。

1.3 實驗方法

將流路圖按圖1所示連接，開啟化學發(fā)光儀，超聲發(fā)生器，設置化學發(fā)光儀負高壓為600V。分別進行聲致化學發(fā)光池中溶液體積、超聲脈沖作用時間、超聲脈沖間隔以及l(fā)uminol濃度對SCL強度和精密度影響的考察。

1.3.1 聲致化學發(fā)光池溶液體積的考察 聲致化學發(fā)光池中溶液體積影響SCL的強度和精密度。在固定luminol濃度為1.0×10－6mol/L，超聲脈沖作用時間為0.5s，超聲脈沖間隔時間為10s的情況下，分別考察在1.0～10.0mL不同溶液體積對SCL強度和精密度的影響。

1.3.2 超聲脈沖作用時間的考察 超聲脈沖作用時間影響SCL的強度和精密度。在固定luminol濃度為1.0×10－6mol/L，超聲脈沖間隔時間為10s，聲致化學發(fā)光池中溶液體積為5mL的情況下，考察了在0.1～10s時間范圍內(nèi)超聲脈沖作用時間對SCL強度和精密度的影響。

1.3.3 超聲脈沖間隔的考察 超聲脈沖間隔影響SCL的強度和精密度。在固定luminol濃度為1.0×10－6mol/L，超聲脈沖作用時間為0.1s，聲致化學發(fā)光池中溶液體積為5mL的情況下，考察了在2～18s時間范圍內(nèi)超聲脈沖間隔時間對SCL強度和精密度的影響。

1.3.4 luminol濃度的考察 發(fā)光試劑luminol濃度是影響SCL強度和精密度的決定因素。在超聲脈沖作用時間為0.1s，超聲脈沖間隔時間為10s，聲致化學發(fā)光池中溶液體積為5mL的情況下，考察了在1.0×10－7～1.0 ×10－3mol/L 范圍內(nèi)不同濃度的 luminol溶液對SCL強度和精密度的影響。

1.3.5 水果抗氧化能力的測定 在luminol濃度為1.0×10－3mol/L，超聲脈沖作用時間為0.1s，超聲脈沖間隔時間為10s，聲致化學發(fā)光池中溶液體積為5mL的最優(yōu)實驗條件下，對選定的十二種水果的抗氧化能力進行了測定。具體操作如下:準確移取2.5mL，1.0×10－3mol/L魯米諾溶液和2.5mL二次水于10mL燒杯中，用注射器將5.0mL將溶液導入聲致化學發(fā)光池，開啟時間繼電器，超聲發(fā)生器按設定的時間循環(huán)工作5次，檢測到的聲致化學發(fā)光強度為I0，關閉時間繼電器，用注射器將聲致化學發(fā)光池中的廢液導出，用二次水將其清洗3次;準確移取2.5mL，1.0×10－3mol/L魯米諾溶液和2.5mL不同濃度的樣品溶液于10mL燒杯中，重復以上測定，檢測到聲致化學發(fā)光強度為I，以清除率表示抗氧化活性的能力強弱。

2 結果與討論

2.1 聲致化學發(fā)光池溶液體積的影響

圖2顯示了在1.0～10.0mL不同溶液體積對SCL強度和精密度的影響。結果表明，當溶液體積小于5.0mL，SCL強度隨樣品體積的增大而增大，超過5.0mL，SCL強度增大的趨勢不明顯。從測定結果的相對標準偏差值可以看出，當溶液體積為5.0mL時可以得到最好的精密度。因此，后續(xù)實驗選用溶液體積為5.0mL。

圖2 溶液體積對聲致化學發(fā)光重現(xiàn)性的影響Fig.2 The effect of solution vloume on SCL

2.2 超聲脈沖作用時間的影響

圖3顯示了在0.1～10s時間范圍內(nèi)，超聲脈沖時間對SCL體系強度和精密度的影響。結果表明，當超聲脈沖作用時間越長體系的精密度越差，當超聲脈沖作用時間為0.1s時，體系的精密度最好。這可能是由于超聲空化氣泡崩塌時所產(chǎn)生的瞬間高溫帶來的熱量累積使得體系本體溶液的溫度不斷上升，而本體溶液的溫度變化恰恰不利于SCL分析體系的精密度。因此，相對短的超聲脈沖作用時間有利于得到相對好的重現(xiàn)性。故后續(xù)實驗中，選擇超聲脈沖作用時間為0.1s。

圖3 超聲脈沖時間td對聲致化學發(fā)光重現(xiàn)性的影響Fig.3 The effect of ultrasonic pulse duration tdon SCL

2.3 超聲脈沖間隔的影響

如圖4顯示了在2～18s范圍內(nèi)，考察了超聲脈沖間隔對SCL強度和精密度的影響。結果表明，超聲脈沖時間間隔越長，體系的精密度越好，超聲脈沖間隔超過10s后，體系的精密度基本趨于平穩(wěn)，因此，在后續(xù)實驗中，選擇超聲脈沖間隔為10s。

圖4 超聲脈沖時間間隔ti對聲致化學發(fā)光重現(xiàn)性的影響Fig.4 The effect of ultrasonic pulse duration interval tion SCL

2.4 luminol濃度的影響

圖5顯示了在 1.0 ×10－7～1.0 ×10－3mol/L 范圍內(nèi)，luminol不同濃度對SCL強度和精密度的影響。結果表明，發(fā)現(xiàn)隨魯米諾濃度的增大，SCL強度逐漸增大，當濃度為1.0×10－3mol/L時發(fā)光強度最大且有很好的精密度。此外，相對于超聲所產(chǎn)生的OH·的濃度，這一濃度下luminol分子已經(jīng)大大過量，可以保證超聲所產(chǎn)生的OH·完全反應，因此，在后續(xù)實驗中選用魯米諾濃度為1.0×10－3mol/L。

圖5 魯米諾濃度對聲致化學發(fā)光強度的影響Fig.5 The effect of luminol concentration on SCL

2.5 緩沖溶液的選擇

為了實現(xiàn)模擬生理條件下的體外測定抗氧化劑清除OH·的能力，我們選擇使用pH7.4的生理緩沖液。考慮到OH·的強氧化性和超聲空化對有機物的降解作用，我們選擇使用純無機鹽PBS緩沖溶液。

2.6 十二種水果的抗氧化性的比較

在最優(yōu)條件下，實驗考察了在SCL體系中加入不同濃度的柳葉桔、草莓、圣女果、獼猴桃、蘋果、西瓜、油桃、菠蘿、甜瓜、大紅柚、火龍果、贛南臍橙水果汁液后對SCL強度的影響，并計算了相應的清除率，結果如表1所示。

一般用發(fā)光清除率的50%的樣品濃度IC50值來評價樣品對 OH·的清除能力。IC50越小，樣品清除OH·的能力越強，反之，IC50越大，樣品清除OH·的能力越弱。由表2中的線性方程計算出十二種水果的IC50值。結果表明，贛南臍橙清除OH·的能力最強，甜瓜清除OH·的能力最弱。

從實驗結果可以看出，不同水果的抗氧化活性存在較大的差異，主要的原因除了種類不同外，可能的影響因素還包括水果采收時的成熟度、種植生長條件、地域差異、采收后的貯存條件、抗氧化活性物質(zhì)在水果中含量的高低、抗氧化物質(zhì)組成以及不同的抗氧化活性物質(zhì)相互之間的作用有關。從抗氧化性方面分析，所測的十二種水果的抗氧化活性與文獻中測定的結果基本一致［19－22］，對自由基的清除活性順序為贛南臍橙＞大紅柚＞柳葉桔＞菠蘿＞獼猴桃＞草莓＞火龍果＞圣女果＞蘋果＞油桃＞西瓜＞甜瓜。最強的與最弱的相差6倍。

表1 12種水果對OH·清除的結果Table 1 The OH·scavenging capacities of twelve kinds of fruits

續(xù)表

表2 12種水果的OH·清除率與聲致化學發(fā)光的關系(n=5)Table 2 The linear relationship between the term，SCL and the OH·scavenging capacities of twelve kinds of fruits(n=5)

3 結論

3.1 采用SCL分別測定了十二種水果對OH·清除的能力，實驗結果表明，十二種水果清除自由基的活性順序為:贛南臍橙＞大紅柚＞柳葉桔＞菠蘿＞獼猴桃＞草莓＞火龍果＞圣女果＞蘋果＞油桃＞西瓜＞甜瓜。

3.2 我們建立的SCL法，具有分析頻率高、穩(wěn)定性好、操作簡單、安全快速、耗費低、靈敏度高的優(yōu)點，可用于多種果蔬、飲料制品、天然產(chǎn)物及藥物的抗氧化性的研究，進一步拓寬了聲致化學發(fā)光法的應用領域。

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