李欣憶　段丁瑜　王盼盼　韓波　徐屹

[摘要] 目的 探討牙齦組織中是否存在β防御素-4（hBD-4）及其分布情況。方法 收集健康牙齦標本。采用免

疫組織化學法檢測18例牙齦組織標本hBD-4蛋白水平的分布；提取組織RNA，進行實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（real time RT-PCR）檢測30例牙齦標本中hBD-4基因的表達水平。結(jié)果 免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，18例牙齦樣本中有13例檢出hBD-4；real time RT-PCR檢測結(jié)果顯示，30例牙齦組織中4例樣本檢測出hBD-4表達。結(jié)論 hBD-4在健康牙齦組織中有不同水平的表達和分布，可能在維持牙周組織健康中起作用。

[關(guān)鍵詞] 牙齦； 人β防御素-4； 免疫組織化學； 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應

[中圖分類號] Q 26 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.013

防御素是一族富含半胱氨酸殘基的陽離子短肽，根據(jù)6個半胱氨酸殘基的位置和連接差異，人防御素可以分為α防御素和β防御素（human β defensin，

hBD）[1]。其中，hBD由哺乳動物單核細胞/巨噬細胞、上皮細胞等產(chǎn)生，主要分布在脊椎動物的皮膚、黏膜等上皮組織，在機體宿主-環(huán)境的界面位置，構(gòu)成機體非特異性天然免疫系統(tǒng)中抵御外界傷害刺激的第一道生化屏障。hBD通過直接殺滅和/或使細菌、真菌及病毒等病原因子某部分失活，阻止病原菌入侵[2]；還可能調(diào)節(jié)獲得性免疫的重要信號分子，對

單核細胞、T細胞等具有選擇性趨化作用[3]，從而加速免疫和傷口愈合過程，對炎癥起調(diào)節(jié)作用。

迄今發(fā)現(xiàn)4種人hBD，分別為hBD-1、hBD-2、hBD-3、hBD-4，可在呼吸道上皮、牙齦上皮、泌尿生殖器上皮、鼻黏膜、眼內(nèi)組織、毛細血管內(nèi)皮細胞、腸上皮、前列腺上皮[4-5]等組織中被檢出。已有大量學者報道了hBD-1、hBD-2、hBD-3在牙齦上皮內(nèi)的表達情況。Vardar-Sengul等[6]檢測牙齦組織

中hBD-1的mRNA表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hBD-1在齦炎和侵襲性牙周炎組表達較低，在慢性牙周炎組的表達顯著高于健康對照組。張旭等[7]采用免疫組化

的方法檢測11例健康人、18例慢性牙周炎患者、9例侵襲性牙周炎患者牙齦組織中hBD-2的表達。結(jié)果顯示，健康組hBD-2的表達水平顯著高于慢性牙周炎組。但是，其他組間未見顯著性差異。Lu等[8]

檢測慢性牙周炎和健康人牙齦組織中hBD-3的表達，結(jié)果顯示，88%的樣本可檢測到hBD-3。

hBD-4與其他防御素不同，該防御素在某些上皮中選擇性表達，已有研究證實：在中性粒細胞、甲狀腺、肺、子宮、腎上皮細胞中存在hBD-4[9]。hBD-4在下呼吸道感染的先天性免疫中起重要作用，能特異性抑制大腸桿菌和銅綠假單胞菌[10]，且能對（12-）十四酸佛波酯（-13-）乙酸鹽（phorbol 12-myristate 13-acetate）作出特異性應答[3]。相比健康胃上皮細胞，hBD-4在幽門螺桿菌所致感染或非幽門螺桿菌所致感染胃炎中表達均上調(diào)[11]。Supp等[12]研究證實hBD-4能抑制細菌的耐藥性。Musumeci等[13]用形態(tài)學、免

疫組織化學和蛋白質(zhì)印跡法證實hBD-4在骨關(guān)節(jié)炎患者膝部半月板中高表達。這些研究表明hBD-4在人體多種組織中存在，并且與組織健康有關(guān)系。但是，hBD-4在口腔中的分布情況迄今國內(nèi)外尚未見報道。

本研究采用免疫組織化學技術(shù)和實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（real time reverse transcription-

polymerase chain reaction，real time RT-PCR）方法，從蛋白和基因兩個水平檢測健康牙齦組織中hBD-4的分布情況，為研究該防御素在牙周組織中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

兔二抗Envision免疫組化試劑盒（DAKO公司，德國），兔特異性hBD-4（Santa Cruz公司，美國），二

氨基聯(lián)苯胺（DAB）（Thermo Scientific公司，德國），

QIAGEN RNeasy[R] MiniKit（QIAGEN公司，德國），

iCycler Thermal Cycler儀（Bio-Rad公司，德國）。

1.2 患者信息和標本收集

收集2012年3—5月就診于四川大學華西口腔醫(yī)院牙周科和頜面外科門診行阻生牙拔除或冠延長患者的正常牙齦組織48例。標本收集通過四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室倫理委員會批準。納入標準：牙齦探診出血陰性，無附著喪失，無牙周袋（pocket depth，PD）（PD≤3 mm），影像學檢查患牙及鄰牙均未見牙槽骨吸收。所有病例均無系統(tǒng)性疾病，女性未妊娠。所有受試者均簽署知情同意書。在48例標本中，選取30例（男9例，女21例；年齡18～57歲）標本-80 ℃冷凍保存，用于real time RT-PCR檢測；18例（男8例，女10例；年齡7～41歲）標本放入多聚甲醛中保存，用于免疫組織化學檢測。同時收集臨床資料，包括菌斑指數(shù)、牙齦指數(shù)、牙周袋深度、臨床附著水平、探診出血等臨床指標。

1.3 應用real time RT-PCR檢測在正常牙齦組織中

hBD-4 mRNA的表達

1.3.1 RNA的提取和cDNA的合成 依據(jù)QIAGEN RNeasy[R] MiniKit提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取總RNA，-80 ℃保存。將提取的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，該逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，

PCR）的擴增模版，每個反應管中加入10 μL RNA，用cDNA Reverse Transcription Kits合成cDNA，-20 ℃

保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 定量檢測hBD-4的表達 用iCycler Thermal Cycler儀對hBD-4行real time RT-PCR，SYBR Green作為熒光染料對PCR產(chǎn)物進行實時監(jiān)控。引物由大連寶生物公司合成提供，hBD-4正向引物序列：5-ATGCAGAGACTTGTGCTGCTATTA-3，反向引物序列：5-AGGGTTTTGTACGATTCAGTAAG-3；β-actin正向引物序列：5-CATGGATGATGATATCGC-CGCG-3，反向引物序列：5-ACATGATCTGGGT-CATCTTCTCG-3。反應系統(tǒng)總體積為25 μL：12.5 μL的PCR緩沖液，9.5 μL的無酶水，2 μL的引物，1 μL cDNA作為PCR反應模版。hBD-4的檢測擴增條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 1 min，循環(huán)50次，55 ℃ 1 min，55 ℃ 10 s。β-actin擴增條件為95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，69 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 1 min，循環(huán)50次，55 ℃ 1 min，55 ℃ 10 s。PCR反應結(jié)束后進行溶解曲線分析，以證實擴增產(chǎn)物的特異性，分析是通過實時監(jiān)測SYBR Green的熒光信號強度變化進行的。管家基因β-actin作為參比基因?qū)悠愤M行歸一化處理，由hBD-4引物擴增的PCR產(chǎn)物作為PCR陽性組，水作為陰性對照組。反應結(jié)束后由計算機自動分析出每個樣本目的基因與內(nèi)參基因達到閾值時的循環(huán)圈數(shù)（threshold cycle，Ct），計算目的基因相對于內(nèi)參基因表達的改變倍數(shù)。每個樣本PCR反應重復2～3次。

1.4 免疫組織化學檢測

所有標本在同一時間段、用同一批號（sc-30117）試劑進行染色，采用Strepavidin-Biotin-Peroxidase-complex（Strept-ABC）法，主要步驟分為：石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化，緩血氨酸鹽溶液（Tris-Buffered Saline solution，TBS）洗滌10 min，采用70 mL甲醇和30%過氧化氫700 μL處理10 min（阻斷內(nèi)源性過氧化氫酶），TBS洗滌10 min，加入兔特異性hBD-4抗血清抗體4 ℃孵化過夜，兔二抗Envision室溫孵化30 min，TBS處理10 min，DAB染色8 min，TBS處理10 min，50%蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色1 s，脫水封片。所有標本在同一時間段、同一背景下，應用Aperio Scanscope Virtual scanning顯微圖像分析系統(tǒng)對免疫

組化染色后的切片進行定性檢測，在物鏡20、40倍下攝像分析。

2 結(jié)果

2.1 real time RT-PCR檢測hBD-4在健康牙齦組織

中的表達

采用real time RT-PCR檢測牙齦組織中hBD-4的表達水平，以循環(huán)內(nèi)的檢測結(jié)果記為陽性，30例樣本中有4例樣本檢測出hBD-4的表達，占13%。4例陽性結(jié)果中hBD-4的相對熒光定量見圖1。

2.2 免疫組織化學法檢測hBD-4在牙齦組織中的定

位和分布

在18例健康牙齦標本中，13例牙齦復層鱗狀上皮細胞的細胞核與細胞漿內(nèi)可見棕黃色陽性染色顆粒，即有hBD-4的表達（圖2～3）。

陽性染色區(qū)域包括基底層、棘層、顆粒層、角化層，但主要分布于棘層與顆粒層細胞的細胞核內(nèi)；某些標本棘層與顆粒層細胞胞漿內(nèi)也可見陽性染色區(qū)域，上皮下結(jié)締組織內(nèi)未見hBD-4表達。hBD-4陽性在不同個體內(nèi)存在差異，陽性標本的染色強度有強有弱，某些標本在基底層與角化層細胞胞核內(nèi)也有表達，但在基底層與角化層細胞胞漿內(nèi)未見hBD-4表達。

3 討論

hBD-4基因序列圖譜位于人染色體8p23，可編碼72種氨基酸的前多肽原[5]。人多種組織中已證實有

hBD-4的存在，如hBD-4在胃上皮細胞[3]高度表達，

在中性粒細胞、甲狀腺上皮、肺上皮、子宮上皮、腎上皮細胞表達量較低[5]。研究證實：hBD-4具有廣譜抗菌活性[14]，對大腸桿菌、釀酒酵母菌、金黃色

葡萄球菌、肺炎鏈球菌等的抗菌活性較弱，最低抑菌濃度均大于100 μg·mL-1；但對銅綠假單胞菌和肉葡萄球菌有高效抗菌活性，最低抑菌濃度分別為4.1和4.5 μg·mL-1，且hBD-4對銅綠假單胞菌的抗菌活性是其他β-防御素的6倍[3]。

本實驗用免疫組織化學法和real time RT-PCR研究健康牙齦上皮hBD-4的分布情況，結(jié)果顯示：兩種方法均檢測到健康牙齦組織中存在hBD-4。免疫組織化學法檢測結(jié)果表明：18例標本中有13例能檢測到hBD-4；real time RT-PCR檢測結(jié)果表明：30例標本中有4例標本檢出hBD-4的表達，占13%，表明hBD-4在健康牙齦上皮的基因表達的陽性率較低。本研究結(jié)果顯示hBD-4表達的陽性率基因水平低于蛋白水平，其原因可能是該基因在翻譯水平上存在調(diào)節(jié)；也可能是某些標本在提取RNA、合成cDNA時由于人為的不可遇見因素導致RNA的降解。Krisanaprakornkit等[15-16]研究hBD-1、hBD-2在15例健康牙齦上皮中mRNA的表達，結(jié)果顯示15例樣本均可檢測出hBD-1，14例樣本中檢出hBD-2。Dommisch等[1]研究顯示健康牙齦上皮中hBD-1、hBD-2、hBD-3 mRNA的表達水平差異無統(tǒng)計學意義。可見，hBD-4在健康牙齦上皮的表達特點可能與其他β-防御素存在差異，推測它們在牙齦組織中表達的意義和作用可能不同。

組織學研究已證實牙齦上皮組織有hBD-1、hBD-2、hBD-3蛋白水平的表達。Dale等[17]研究牙周炎患者的牙齦上皮，發(fā)現(xiàn)hBD-1、hBD-2可在牙齦上皮全層中發(fā)現(xiàn)，這與張旭等[7]對hBD-2的研究結(jié)果相同，

該研究發(fā)現(xiàn)hBD-2在健康人和牙周炎患者牙齦上皮細胞層次的分布無明顯差異，主要見于棘層以上細

胞質(zhì)內(nèi)。Lu等[8]研究發(fā)現(xiàn)健康人hBD-3主要位于基底層，而牙周炎患者hBD-3主要位于基底層和棘層。本研究發(fā)現(xiàn)hBD-4主要位于牙齦上皮棘層和顆粒層細胞，尚未在結(jié)締組織中發(fā)現(xiàn)。這些研究表明，迄今發(fā)現(xiàn)的的β-防御素表達部位均在牙齦上皮內(nèi)，這與其在牙齦組織中的天然防御功能可能相關(guān)。

本研究顯示健康人牙齦上皮內(nèi)hBD-4主要位于棘層、顆粒層細胞胞核內(nèi)，少數(shù)樣本棘層與顆粒層細胞胞質(zhì)內(nèi)存在陽性染色區(qū)域。Yanagi等[10]研究表

明慢性下呼吸道感染患者支氣管上皮細胞胞質(zhì)內(nèi)為hBD-4強陽性染色區(qū)域。Musumeci等[13]研究顯示，骨

關(guān)節(jié)炎患者半月板表層細胞和細胞外基質(zhì)內(nèi)均存在hBD-4。這些研究結(jié)果表明hBD-4可分別位于細胞胞核、胞質(zhì)及細胞外基質(zhì)中，這也許與人體不同部位組織特性相關(guān)，是否與不同感染狀態(tài)相關(guān)有待進一步研究證實。

用熱滅活的銅綠假單胞菌或肺炎鏈球菌刺激人呼吸上皮細胞，可增加hBD-4在呼吸上皮細胞的表達[5]，體外肺上皮細胞在（12-）十四酸佛波酯（-13-）乙酸鹽刺激下可增加hBD-4的表達[18]。這為hBD-4

在免疫防御中起作用提供了可靠證據(jù)。在培養(yǎng)的上皮角化細胞中，用基因修飾法異位表達hBD-4，上皮角化細胞抗菌活性顯著增加[9]，這為創(chuàng)口修復中，持續(xù)輸送hBD-4達創(chuàng)傷組織以抵御創(chuàng)口感染的治療方案提供依據(jù)。hBD-4對微生物耐藥性所致感染有較高療效，包括耐甲氧西林金葡菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動桿菌[12]，為耐藥微生物所致感染的治療提

供了新的導航?？谇粸槿梭w四大菌庫之一，單個個體口腔內(nèi)有500余種細菌[19]，但僅部分人會患牙周疾病，這不僅與微生物菌群平衡相關(guān)，宿主防御因素也必不可少，本實驗證實hBD-4在牙齦上皮內(nèi)表達，還需進一步研究探索其在宿主免疫防御中的作用。

[參考文獻]

[1] Dommisch H， A?il Y， Dunsche A， et al. Differential gene expres-

sion of human beta-defensins（hBD-1， -2， -3） in inflammatory

gingival diseases[J]. Oral Microbiol Immunol， 2005， 20（3）：186-

190.

[2] Dale BA. Periodontal epithelium： A newly recognized role in health

and disease[J]. Periodontol 2000， 2002， 30：70-78.

[3] García JR， Krause A， Schulz S， et al. Human beta-defensin 4：

A novel inducible peptide with a specific salt-sensitive spectrum

of antimicrobial activity[J]. FASEB J， 2001， 15（10）：1819-1821.

[4] Lee SH， Lim HH， Lee HM， et al. Expression of human beta-

defensin 1 mRNA in human nasal mucosa[J]. Acta Otolaryngol，

2000， 120（1）：58-61.

[5] Schneider JJ， Unholzer A， Schaller M， et al. Human defensins[J].

J Mol Med（Berl）， 2005， 83（8）：587-595.

[6] Vardar-Sengul S， Demirci T， Sen BH， et al. Human beta defensin-1

and -2 expression in the gingiva of patients with specific perio-

dontal diseases[J]. J Periodontal Res， 2007， 42（5）：429-437.

[7] 張旭， 束蓉， 羅禮君， 等. β-防御素-2多肽在不同類型牙周炎及

健康牙齦組織中的表達[J]. 上?？谇会t(yī)學， 2006， 15（1）：23-27.

Zhang Xu， Shu Rong， Luo Lijun， et al. Expression of human beta

defensin-2 in normal and various periodontitis-involved gingiva[J].

Shanghai J Stomatol， 2006， 15（1）：23-27.

[8] Lu Q， Samaranayake LP， Darveau RP， et al. Expression of human

beta-defensin-3 in gingival epithelia[J]. J Periodontal Res， 2005，

40（6）：474-481.

[9] Smiley AK， Gardner J， Klingenberg JM， et al. Expression of human

beta defensin 4 in genetically modified keratinocytes enhances an-

timicrobial activity[J]. J Burn Care Res， 2007， 28（1）：127-132.

[10] Yanagi S， Ashitani J， Ishimoto H， et al. Isolation of human beta-

defensin-4 in lung tissue and its increase in lower respiratory tract

infection[J]. Respir Res， 2005， 6：130.

[11] Otte JM， Neumann HM， Brand S， et al. Expression of beta-de-

fensin 4 is increased in human gastritis[J]. Eur J Clin Invest， 2009，

39（2）：126-138.

[12] Supp DM， Gardner J， Klingenberg JM， et al. Antibiotic resistance

in clinical isolates of Acinetobacter baumannii， Pseudomonas aeru-

ginosa， and Staphylococcus aureus does not impact sensitivity to

human beta defensin 4[J]. Burns， 2009， 35（7）：949-955.

[13] Musumeci G， Carnazza ML， Leonardi R， et al. Expression of β-

defensin-4 in “an in vivo and ex vivo model” of human osteoar-

thritic knee meniscus[J]. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，

2012， 20（2）：216-222.

[14] Li JF， Zhang J， Zhang Z， et al. Production of bioactive human

beta-defensin-4 in Escherichia coli using SUMO fusion partner

[J]. Protein J， 2010， 29（5）：314-319.

[15] Krisanaprakornkit S， Weinberg A， Perez CN， et al. Expression of

the peptide antibiotic human beta-defensin 1 in cultured gingival

epithelial cells and gingival tissue[J]. Infect Immun， 1998， 66（9）：

4222-4228.

[16] Krisanaprakornkit S， Kimball JR， Weinberg A， et al. Inducible ex-

pression of human beta-defensin 2 by Fusobacterium nucleatum in

oral epithelial cells： Multiple signaling pathways and role of com-

mensal bacteria in innate immunity and the epithelial barrier[J].

Infect Immun， 2000， 68（5）：2907-2915.

[17] Dale BA， Kimball JR， Krisanaprakornkit S， et al. Localized anti-

microbial peptide expression in human gingiva[J]. J Periodontal

Res， 2001， 36（5）：285-294.

[18] Kawahara T， Kuwano Y， Teshima-Kondo S， et al. Toll-like re-

ceptor 4 regulates gastric pit cell responses to Helicobacter pylori

infection[J]. J Med Invest， 2001， 48（3/4）：190-197.

[19] Zaura E， Keijser BJ， Huse SM， et al. Defining the healthy “core

microbiome” of oral microbial communities[J]. BMC Microbiol， 2009，

9：259.

（本文編輯 杜冰）