趙寧波　楊凱　唐洪　趙春蓉　陳丹　陳睿

[摘要] 目的 比較奧沙利鉑（L-OHP）在晝夜4個(gè)不同時(shí)間治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的療效和不良反應(yīng)的差異，并分析其晝夜生物節(jié)律特征。方法 將75只裸鼠置于12 h光照/12 h黑暗交替的環(huán)境中，將人頰鱗狀細(xì)胞癌BcaCD885細(xì)胞注入裸鼠頰部建立口腔頰鱗狀細(xì)胞癌模型，3周成瘤后隨機(jī)分為5組（4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，1個(gè)對(duì)照組），每組15只。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別在24 h內(nèi)的4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，即燈亮后4、10、16、22 h（4 HALO、10 HALO、16 HALO、22 HALO）分別靜脈注射L-OHP（17 mg·kg-1），對(duì)照組靜脈注射相同體積的生理鹽水。給藥后觀察比較各組的療效（抑瘤率和生存時(shí)間）、

不良反應(yīng)（體重、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和肛周腫脹）情況，并用余弦分析法檢驗(yàn)療效和不良反應(yīng)是否具有晝夜節(jié)律性。結(jié)果 在4、16和22 HALO時(shí)間注射L-OHP均獲得較好的抑瘤率，但只有在16和22 HALO兩個(gè)時(shí)間給藥顯著延長(zhǎng)了荷瘤鼠的生存時(shí)間；在16和22 HALO時(shí)間給藥，荷瘤鼠的不良反應(yīng)顯著小于4和10 HALO給藥；余弦分析表明不同給藥時(shí)間對(duì)小鼠的生存時(shí)間、體重和白細(xì)胞計(jì)數(shù)的改變具有明顯的晝夜節(jié)律變化特征，其中14.88 HALO注射L-OHP荷瘤鼠的生存時(shí)間最長(zhǎng)。結(jié)論 用L-OHP對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌患者化療應(yīng)考慮時(shí)間因素，以增效減毒、提高患者生存率和生存質(zhì)量。

[關(guān)鍵詞] 時(shí)辰治療； 鱗狀細(xì)胞； 口腔癌； 療效； 不良反應(yīng)； 晝夜節(jié)律

[中圖分類號(hào)] R 739.8 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.005

口腔癌約占全身惡性腫瘤的2%，其中90%為鱗狀細(xì)胞癌。盡管手術(shù)、化療和放療取得了一些進(jìn)步，但口腔癌患者的5年總生存率仍然只有50%～60%[1-2]，因此，探索口腔癌新型有效的治療方法具有重大意義。

人體的許多生理活動(dòng)，如細(xì)胞新陳代謝和增殖等，在體內(nèi)“生物鐘”的調(diào)控下具有明顯的晝夜生

物節(jié)律性，生物鐘的調(diào)控中樞位于人體下丘腦基底部的視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN），它通過神經(jīng)介質(zhì)和激素使人體的生理活動(dòng)隨24 h明暗交替呈規(guī)律性變化[3-4]。目前研究發(fā)現(xiàn)：人體正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖以及影響藥物分解代謝酶的活性有明顯的時(shí)間節(jié)律，使一些抗癌藥物隨給藥時(shí)間的不同抗癌活性和不良反應(yīng)產(chǎn)生顯著差異[5]。時(shí)辰化療就是根據(jù)機(jī)體自身生物節(jié)律，選擇合適用藥時(shí)間，以達(dá)到最大療效和最小不良反應(yīng)，提高患者的生存率和生存質(zhì)量[5-6]。

鉑類抗癌藥物是目前治療口腔鱗狀細(xì)胞癌最常用和最有效的藥物之一，目前研究顯示：鉑類藥物的抗癌活性和不良反應(yīng)具有晝夜時(shí)辰特征[4-5]。為了深入了解鉑類藥物對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌的時(shí)辰作用和規(guī)律，本研究將人口腔頰鱗狀細(xì)胞癌BcaCD885細(xì)胞注入裸鼠頰部，建立裸鼠BcaCD885頰鱗狀細(xì)胞癌模型，用第3代新型鉑類抗癌藥物奧沙利鉑（Oxaliplatin，L-OHP）在晝夜4個(gè)不同時(shí)間給藥，觀察和比較不同時(shí)間給藥后藥物的抑瘤率、小鼠生存時(shí)間和不良反應(yīng)，并行余弦分析檢驗(yàn)不同時(shí)間給藥的療效和不良反應(yīng)是否有晝夜節(jié)律性以及晝夜節(jié)律性規(guī)律，為臨床更加安全、有效地用藥提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

人頰鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株BcaCD885（四川大學(xué)口

腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），L-OHP、RPMI 1640培養(yǎng)基（Sigma公司，美國），胎牛血清（Gibco公司，美國），冷凍低速離心機(jī)（Z233MK-2，HERMLE公

司，德國），光學(xué)顯微鏡（CYMML-EPXFU-068，Ni-kon公司，日本）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的無特定病原體（SPF）級(jí)別BALB/c nu/nu品系裸鼠75只為研究對(duì)象，雌性，5～6周齡，體重19～20 g。

1.3 方法

1.3.1 裸鼠BcaCD885頰鱗狀細(xì)胞癌模型的建立 將75只裸鼠置于標(biāo)準(zhǔn)化12 h光照/12 h黑暗環(huán)境中分籠飼養(yǎng)，每籠5只，墊料、飼料和飲水均經(jīng)滅菌處理，室溫為（24±1） ℃，空氣濕度為60%±10%。時(shí)間以開燈后時(shí)間（hours after lights on，HALO）為參考，0 HALO為開燈時(shí)間，12 HALO為關(guān)燈時(shí)間，即12 HALO前為休息相，12 HALO后為活動(dòng)相。實(shí)驗(yàn)前，裸鼠在此環(huán)境中適應(yīng)3周。所有實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)過重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

將BcaCD885細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，然后放入37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BcaCD885細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰酶消化，冷凍低速離心（4 ℃，1 000 r·min-1，離心

半徑3 cm）5 min后，用無菌PBS配制成單細(xì)胞懸液。將0.2 mL含有2×106個(gè)BcaCD885細(xì)胞的懸液植入裸鼠頰部，繼續(xù)在標(biāo)準(zhǔn)化12 h光照/12 h黑暗環(huán)境中分籠飼養(yǎng)。每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，3周明顯成瘤后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 給藥方法和時(shí)間 按照隨機(jī)數(shù)字表法，將75只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為5組，每組15只，即4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組。將L-OHP粉末用0.9%生理鹽水配制成濃度為3.4 g·L-1溶液。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別在24 h內(nèi)的4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，即燈亮后4、10、16、22 h（4 HALO、10 HALO、16 HALO、22 HALO）分別尾靜脈注射L-OHP（17 mg·kg-1），而對(duì)照組在以上4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)

尾靜脈注射相同體積的0.9%生理鹽水。

1.3.3 療效評(píng)價(jià) 療效評(píng)價(jià)指標(biāo)如下。1）抑瘤率：在給藥后第7天的22 HALO時(shí)，用游標(biāo)卡尺對(duì)5組裸鼠腫瘤的最大徑（a）和最小徑（b）進(jìn)行測(cè)量，腫瘤體積（V）=0.5ab2，抑瘤率=（對(duì)照組腫瘤平均體積-給藥組腫瘤平均體積）/對(duì)照組腫瘤平均體積×100%。2）生存時(shí)間：給藥后每只荷瘤鼠存活的天數(shù)。

1.3.4 不良反應(yīng) 用外周血白細(xì)胞（white blood cell，

WBC）計(jì)數(shù)、荷瘤鼠體重和肛周腫脹率評(píng)估不良反應(yīng)。即在給藥后第7天，用電子天平稱重裸鼠體重，觀察裸鼠肛周腫脹情況；用清潔干燥的微量血紅蛋白吸管刺入裸鼠尾靜脈吸取靜脈血20 μL，用人工血細(xì)胞計(jì)數(shù)方法檢測(cè)外周血WBC數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Sigmaplot 12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多均數(shù)比較用方差分析，率的比較用??2檢驗(yàn)；應(yīng)用CircWave V 1.4軟件行余弦分析，檢驗(yàn)各指標(biāo)是否具有晝夜節(jié)律性；繪制Kaplan-Meier生存曲線，用log-rank方法檢驗(yàn)組間生存時(shí)間的差異性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組荷瘤鼠抑瘤率的比較

晝夜4個(gè)不同時(shí)間注射L-OHP 7 d后各組抑瘤率的測(cè)量結(jié)果見表1。不同時(shí)間給藥其抑瘤率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（??2=96.54，P<0.001）。在10 HALO給藥抑瘤率最小，顯著低于其他3個(gè)時(shí)間給藥的抑瘤率；在4、16和22 HALO時(shí)間注射L-OHP均獲得較好的抑瘤率，但三者抑瘤率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 各組荷瘤鼠生存時(shí)間的比較

5組荷瘤鼠的平均生存時(shí)間見表1。5組荷瘤鼠的

平均生存時(shí)間的總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.264，

P<0.001）。其中，4 HALO組和10 HALO組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），即表明在4 HALO和10 HALO時(shí)間點(diǎn)用藥未顯著延長(zhǎng)荷瘤鼠生存時(shí)間。16 HALO組和22 HALO組與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），證明在16 HALO和22 HALO時(shí)間點(diǎn)用

藥顯著延長(zhǎng)了荷瘤鼠的生存時(shí)間，但是16 HALO和22 HALO組間小鼠生存時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。以上證明在活動(dòng)相注射L-OHP能顯著延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存時(shí)間。

余弦分析表明：不同時(shí)間注射L-OHP后荷瘤鼠的平均生存時(shí)間有晝夜節(jié)律性（F=7.95，P=0.000 9）。

根據(jù)余弦擬合曲線顯示：2.86 HALO時(shí)注射L-OHP荷瘤鼠生存時(shí)間最短，為12.02 d；14.88 HALO時(shí)注射L-OHP荷瘤鼠生存時(shí)間最長(zhǎng)，為20.75 d（圖1）。

Kaplan-Meier生存曲線分析：10 HALO組裸鼠生存時(shí)間最短，16 HALO組裸鼠生存時(shí)間最長(zhǎng)（log-rank ??2=13.84，P<0.01），具體見圖2。

2.3 各組荷瘤鼠不良反應(yīng)的比較

2.3.1 WBC計(jì)數(shù) 在晝夜4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)注射L-OHP后荷瘤鼠的WBC均發(fā)生顯著性減少，其中，10 HALO組WBC減少最多，16 HALO組WBC減少最少。5組荷瘤鼠WBC的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=274.42，P<0.001），

并且不同組之間兩兩比較荷瘤鼠WBC的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）（表1）。余弦分析表明：不同

時(shí)間注射L-OHP后荷瘤鼠的WBC減少具有晝夜節(jié)律性（F=62.13，P<0.001）。根據(jù)余弦擬合曲線顯示：

18.80 HALO注射L-OHP導(dǎo)致荷瘤鼠WBC減少最少，

為15.43×103·μL-1，6.81 HALO注射L-OHP導(dǎo)致荷瘤鼠WBC減少最多，為14.19×103·μL-1（圖3）。

2.3.2 荷瘤鼠體重 5組荷瘤鼠體重的總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=41.48，P<0.001），其中，10 HALO組和

對(duì)照組之間荷瘤鼠的體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.548，

P>0.05）。4 HALO、16 HALO以及22 HALO組與對(duì)照組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但4 HALO和22 HALO組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），16 HALO與4 HALO和22 HALO之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。余弦分析表明：不同時(shí)間點(diǎn)注射L-OHP后荷瘤鼠的體重具有晝夜節(jié)律性（F=3.49，P<0.05），根據(jù)余弦擬合曲線顯示：16.85 HALO注射L-OHP后荷瘤鼠體重值最大，為19.20 g，4.85 HALO注射L-OHP荷瘤鼠體重值最小，為18.85 g（圖4）。

2.3.3 肛周腫脹率 5組荷瘤鼠肛周腫脹率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（??2=16.996，P<0.01）。10 HALO組肛周腫脹率最高，為60.00%（9/15）；16 HALO組肛周腫脹率最低，為13.33%（2/15）。4 HALO和10 HALO組與16 HALO組之間荷瘤鼠的肛周腫脹率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<

0.05），但16 HALO和22 HALO之間荷瘤鼠肛周腫脹率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。證明在活動(dòng)相注射L-OHP較休息相顯著降低了荷瘤鼠的肛周腫脹率。

3 討論

化療是口腔鱗狀細(xì)胞癌綜合治療的重要組成部分。鉑類抗癌藥物是目前治療口腔癌最常用和最有效的藥物之一，目前在臨床上用于口腔鱗狀細(xì)胞癌的化療方案幾乎全部含有鉑類抗癌藥物[7]。L-OHP是

近年來研制出的第三代鉑類抗癌藥物，含有一個(gè)1，2二氨環(huán)己烷基團(tuán)（DACH），L-OHP活化后DACH環(huán)和

鉑與癌細(xì)胞的DNA結(jié)合成鉑-DNA復(fù)合體，形成鏈內(nèi)及鏈間交聯(lián)，從而阻止DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞周期非特異性死亡[8]。目前研究證明：人體正常細(xì)

胞和腫瘤細(xì)胞的增殖、DNA合成水平有明顯的晝夜時(shí)間節(jié)律，增殖和DNA合成越活躍的細(xì)胞對(duì)化療藥物越敏感，由于腫瘤細(xì)胞DNA合成和增殖的時(shí)間節(jié)律變化與人體正常細(xì)胞（骨髓、消化道黏膜上皮等）之間一般存在8～12 h時(shí)差，這就為不同時(shí)間應(yīng)用化療藥物既能最大殺傷癌細(xì)胞，同時(shí)又盡量減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷提供了基礎(chǔ)[4-6]。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有30多種細(xì)胞毒藥物具有時(shí)辰化療的特點(diǎn)，目前許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和一些多醫(yī)療中心通過時(shí)辰治療結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌等臨床經(jīng)驗(yàn)證實(shí)[4-6，9-10]：金屬鉑類抗癌藥物在不同時(shí)間用藥所產(chǎn)生的抗癌療效和對(duì)機(jī)體的不良反應(yīng)具有顯著性差異。筆者前期的臨床研究也證明：卡鉑抗癌藥物對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌患者在不同時(shí)間用藥可達(dá)到減毒增效的目的[11]。但

目前腫瘤的時(shí)辰化療研究主要是集中在對(duì)藥物近期療效的觀察，缺乏長(zhǎng)期療效，如生存率的比較觀察。實(shí)驗(yàn)常是對(duì)鉑類抗癌藥物聯(lián)合其他藥物的聯(lián)合化療方案的總體結(jié)果觀察，缺乏對(duì)鉑類抗癌藥物單一化療作用的觀察。另外，目前的腫瘤時(shí)辰治療研究通常只是比較不同時(shí)間用藥后療效和不良反應(yīng)的差異，沒有對(duì)其是否具有晝夜生物節(jié)律性進(jìn)行驗(yàn)證和分析。目前以余弦函數(shù)為模型發(fā)展起來的余弦分析是分析生物節(jié)律性資料的有效方法，它能排除其他生物因素的干擾，將需要研究的生物節(jié)律分離，并將其特征用余弦擬合曲線直觀地表示出來[12]。

在臨床上L-OHP常和其他抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用，本研究用單一L-OHP治療，其目的是更好發(fā)現(xiàn)L-OHP治療口腔鱗狀細(xì)胞癌的晝夜時(shí)辰特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)：在10 HALO時(shí)間給藥荷瘤鼠的抑瘤率和生存時(shí)間顯著低于其他給藥時(shí)間，盡管4 HALO時(shí)間給藥的抑瘤率與16和22 HALO時(shí)間給藥的抑瘤率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但4 HALO時(shí)間給藥并沒有延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存時(shí)間，只有在16和22 HALO兩個(gè)時(shí)間給藥顯著延長(zhǎng)了荷瘤鼠的生存時(shí)間。同時(shí)余弦分析證明不同時(shí)間注射L-OHP后荷瘤鼠的平均生存時(shí)間具有晝夜節(jié)律性，根據(jù)擬合的余弦曲線可知，2.86 HALO時(shí)（休息

相早期）注射L-OHP荷瘤鼠生存時(shí)間最短，為12.02 d；14.88 HALO時(shí)（活動(dòng)相早期）注射L-OHP荷瘤鼠生存時(shí)間最長(zhǎng)，為20.75 d。

由于L-OHP的主要不良反應(yīng)為骨髓抑制、消化道黏膜上皮損傷[8]。本研究選擇給藥后小鼠的體重（反映體質(zhì)狀況）、WBC計(jì)數(shù)（反映骨髓抑制情況）和肛周腫脹（反映胃腸道毒性情況）來評(píng)價(jià)不良反應(yīng)[8，13]。本研究發(fā)現(xiàn)：在4、10、16和22 HALO 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)用藥7 d后荷瘤鼠的體重、WBC計(jì)數(shù)和肛周腫脹率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。10 HALO給藥后小鼠體重最輕，16 HALO給藥后小鼠體重最重，即證明在16 HALO用藥對(duì)小鼠全身體質(zhì)狀況影響最小。余弦分析證明不同時(shí)間注射L-OHP后荷瘤鼠的體重有晝夜節(jié)律性，16.85 HALO（活動(dòng)相中期）注射L-OHP對(duì)荷瘤鼠體重影響最小，即對(duì)全身體質(zhì)狀況影響最?。?.85 HALO（休息

相中期）注射L-OHP對(duì)荷瘤鼠體重影響最大，即對(duì)荷

瘤鼠全身體質(zhì)狀況影響最大。WBC計(jì)數(shù)結(jié)果也表明：

在10 HALO給藥后小鼠WBC減少最多，16 HALO組WBC減少最少，即證明在16 HALO給藥對(duì)小鼠骨髓抑制最輕。余弦分析證明不同時(shí)間注射L-OHP后荷瘤鼠的WBC具有晝夜節(jié)律性，18.80 HALO（活動(dòng)相

中期）注射L-OHP導(dǎo)致荷瘤鼠WBC減少最少，即對(duì)骨髓抑制最小；6.81 HALO（休息相中期）注射L-OHP

導(dǎo)致荷瘤鼠WBC減少最多，即對(duì)骨髓抑制最大。肛周腫脹結(jié)果也表明：在10 HALO（休息相晚期）注射L-OHP后荷瘤鼠肛周腫脹率最高（60.00%），證明對(duì)胃

腸道毒性作用最大，在16 HALO（活動(dòng)相早期和中期的轉(zhuǎn)化時(shí)期）給藥肛周腫脹率最低（13.33%），對(duì)胃腸道毒性作用最小。

目前越來越多的學(xué)者認(rèn)為：化療用藥時(shí)間的合理安排與用藥劑量具有同等重要的地位[14]。本研究

表明：在晝夜不同時(shí)間用L-OHP靜脈注射治療口腔鱗狀細(xì)胞癌其產(chǎn)生的療效和不良反應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且這種差異的波動(dòng)具有24 h晝夜節(jié)律性，在16和22 HALO兩個(gè)時(shí)間用L-OHP能顯著延長(zhǎng)口腔鱗狀細(xì)胞癌小鼠的生存時(shí)間?？傮w來看：L-OHP在活動(dòng)相早期的后段時(shí)間和中期的前段時(shí)間用藥所獲得的療效最好，不良反應(yīng)最??；而在休息相早期和中期給藥，其療效最差，不良反應(yīng)最大。盡管鼠類是夜行動(dòng)物，其休息相和活動(dòng)相與人類相反，但目前研究證明：從鼠類的休息相和活動(dòng)相所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以外推到人的相應(yīng)休息相和活動(dòng)相[5-6]。因此，對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的化療應(yīng)考慮時(shí)間因素，以增效減毒、提高患者生存率和生存質(zhì)量。

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（本文編輯 杜冰）