羅菲　盧來春　曾勇　趙智亮　祝金香　張綱

[摘要] 目的 探討改性后聚乳酸（PLA）包裹骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）制備的納米微球緩釋系統(tǒng)對兔下頜骨缺損的修復(fù)效果。方法 將PLA進行接枝聚合反應(yīng)改性后，應(yīng)用超聲乳化法制備PLA納米微球（PLA-Ns）、BMP-2-PLA

納米微球（BMP-2-PLA-Ns）凝膠。將45只家兔隨機分為3組：空白組、PLA-Ns凝膠組（對照組）、BMP-2-PLA-Ns凝膠組（實驗組），建立骨缺損動物模型，對照組植入PLA-Ns凝膠，實驗組植入BMP-2-PLA-Ns凝膠，空白組不予特

殊處理。術(shù)后第1、2、4周處死家兔，截取缺損區(qū)頜骨段，進行影像學(xué)、蘇木精-伊紅（HE）染色、PCNA免疫組織化學(xué)染色觀察。結(jié)果 影像學(xué)觀察可見：實驗組骨缺損區(qū)修復(fù)良好，陰影不明顯，修復(fù)效果好于對照組和空白組。HE染色觀察可見：實驗組和對照組有大量新生血管和繼發(fā)性骨痂形成，實驗組骨痂比例明顯高于對照組和空白組。免疫組織化學(xué)觀察可見：第1、2周，實驗組PCNA陽性軟骨細(xì)胞多于對照組和空白組；第4周，各組PCNA陽性細(xì)胞均罕見，PCNA陽性細(xì)胞檢出率低于第1、2周。結(jié)論 BMP-2-PLA-Ns緩釋系統(tǒng)能明顯促進下頜骨缺損修復(fù)。

[關(guān)鍵詞] 聚乳酸； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白； 下頜骨； 骨缺損； 修復(fù)

[中圖分類號] R 782.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.010

因腫瘤、外傷等造成的頜骨缺損修復(fù)一直是外科醫(yī)生的一個難題。目前臨床上所運用的修復(fù)方法都有著不同的局限性，探索更好的骨缺損修復(fù)方法是研究的熱點。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morpho-

genetic protein-2，BMP-2）在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)新骨的

形成，在體外對人骨髓基質(zhì)細(xì)胞有強烈的骨誘導(dǎo)活性，能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化為成骨細(xì)胞，并由誘導(dǎo)性骨細(xì)胞向確定性骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[1]。研究表

明，BMP-2可以誘導(dǎo)異位骨的形成，并誘導(dǎo)臨界骨缺損骨性愈合[2]。由于細(xì)胞因子本身的降解速度快，如果單獨在缺損區(qū)局部應(yīng)用BMP-2等細(xì)胞生長因子，體內(nèi)作用時間短，不能持續(xù)地在體內(nèi)發(fā)揮作用，因而需要采用合適的高分子生物材料為載體包裹BMP-2，以達(dá)到緩釋效果[3]。聚乳酸（polylactic acid，PLA）由于具有良好的生物相容性和可降解性，被大量用于實驗中作為支架材料。但是好的支架材料不但要滿足一般的生物材料要求，還需要具備良好的細(xì)胞親和性。PLA的缺點在于缺乏細(xì)胞的活性功能基團，不能很好地使材料和細(xì)胞相互作用。

本實驗針對PLA存在的缺陷，對PLA采用接枝聚合的方法進行表面修飾，改善PLA的親水性，增加細(xì)胞黏附性。以改性后的PLA作為BMP-2納米微球的緩釋載體，制備BMP-2-PLA納米微球（BMP-2-PLA nanospheres，BMP-2-PLA-Ns）凝膠，以單純性PLA納米微球（PLA nanospheres，PLA-Ns）凝膠為對照，研究BMP-2-PLA-Ns緩釋系統(tǒng)對頜骨缺損的修復(fù)效果，為臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料和設(shè)備

PLA（濟南岱罡生物有限科技公司），重組人BMP-2蛋白（北京義翹神州生物技術(shù)有限公司），泊洛沙

姆407（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院藥劑科贈送），PCNA

marker（Abcam公司，英國），超聲破碎儀（寧波新芝科學(xué)儀器研究所）。

1.2 PLA-Ns凝膠、BMP-2-PLA-Ns凝膠的制備

將PLA進行接枝聚合反應(yīng)改性后，應(yīng)用超聲乳化法制備PLA-Ns、BMP-2-PLA-Ns凝膠。具體制備方法如下。1）PLA改性：PLA置于低溫等離子接枝聚合儀反應(yīng)腔中，等離子處理后通過氣相法進行接枝聚合反應(yīng)改性，將乙烯基吡咯烷酮與PLA接觸不同時間進行氣相接枝聚合。2）PLA-Ns、BMP-2-PLA-Ns凝膠的制備：將改性后的PLA或者改性后的PLA及BMP-2超聲乳化溶于乙酸乙酯溶液中，超聲波細(xì)胞破碎儀進行超聲破碎，形成O/W初乳。吐溫80混勻成水相，超聲破碎，形成W/O/W復(fù)乳溶液。將復(fù)乳溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)，濾膜過濾溶液，得到納米微球溶液。稱取泊洛沙姆在蒸餾水中溶解，配成40%溶液，溶脹，冰浴，在室溫下成凝膠狀，1∶1比例分別加入制備好的PLA-Ns、BMP-2-PLA-Ns微球溶液，配成凝膠，加蒸餾水?dāng)嚢璩赡浴?/p>

1.3 建立動物模型和標(biāo)本處理

選取45只健康家兔（第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院實驗動物中心提供），雌雄不限，體重（2.0±0.2） kg。將

45只家兔完全隨機分為3組：空白組、PLA-Ns凝膠組（對照組）、BMP-2-PLA-Ns凝膠組（實驗組），每組各15只。建立骨缺損動物模型（圖1）：麻醉成功后，常規(guī)消毒，鋪巾，無菌操作下制備0.5 cm×0.5 cm大小的骨缺損區(qū)。根據(jù)分組，對照組植入PLA-Ns凝膠，實驗組植入BMP-2-PLA-Ns凝膠，空白組不予特殊處理，沖洗縫合。術(shù)后第1、2、4周采用空氣栓塞法將每組家兔各處死5只，截取缺損區(qū)頜骨段，浸泡于10%甲醛溶液中4 ℃固定24 h。

1.4 影像學(xué)觀察

對缺損區(qū)頜骨段進行影像學(xué)觀察，拍攝側(cè)位片。

1.5 蘇木精-伊紅（hematine eosin，HE）染色和免疫

組織化學(xué)染色觀察

對缺損區(qū)頜骨段標(biāo)本進行常規(guī)HE染色和免疫組織化學(xué)染色，光鏡下進行組織學(xué)觀察。免疫組織化學(xué)染色：常規(guī)制作標(biāo)本，石蠟包埋切片，脫蠟，緩沖液洗，滴加一抗PCNA marker和酶標(biāo)二抗HRP Po-lymer，復(fù)染，脫水，透明，封片，光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)觀察

影像學(xué)觀察可見：第1周，頜骨缺損區(qū)處于水腫期，愈合不明顯；第2周，缺損區(qū)開始愈合，空白組缺損區(qū)陰影明顯大于實驗組和對照組；第4周，空白組骨缺損區(qū)陰影仍然較大，未見明顯新生骨形成；對照組骨缺損區(qū)陰影縮小，缺損區(qū)周圍有新骨形成；實驗組骨缺損區(qū)修復(fù)良好，陰影已不明顯（圖2）。實驗組對缺損區(qū)的修復(fù)效果好于對照組和空白組。

2.2 HE染色觀察

HE染色觀察可見：第1周，缺損區(qū)肉芽組織中有炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，實驗組可見新生骨小梁；第2周，骨小梁變粗大、致密，有較多的編織骨形成，對照組和實驗組的編織骨多于空白組；第4周，實驗組和對照組的編織骨進一步增多，成熟，可見大量新生血管和繼發(fā)性骨痂形成，實驗組骨痂比例明顯高于對照組和空白組（圖3）。

2.3 免疫組織化學(xué)觀察

免疫組織化學(xué)觀察可見：第1周，PCNA陽性細(xì)胞分布于整個骨痂組織，包括纖維骨痂中的成纖維細(xì)胞和軟骨痂中各區(qū)的軟骨細(xì)胞，其中以靜息區(qū)和增殖區(qū)軟骨細(xì)胞陽性表達(dá)最強，實驗組多于對照組和空白組；第2周，PCNA陽性軟骨細(xì)胞主要分布于靜息區(qū)和增殖區(qū)，實驗組多于對照組和空白組；第4周，各組PCNA陽性細(xì)胞均罕見，PCNA陽性細(xì)胞檢出率低于第1、2周，主要見于靜息區(qū)少數(shù)軟骨細(xì)胞和部分增殖區(qū)軟骨細(xì)胞（圖4）。

3 討論

組織工程化骨構(gòu)建是解決骨缺損修復(fù)難題的主要方向，但目前有很多問題尚未解決。采用外源性細(xì)胞因子誘導(dǎo)新骨的形成來替代移植是一種有效的方法，也取得了一定的進展。

3.1 細(xì)胞生長因子和支架載體技術(shù)的選擇

關(guān)于細(xì)胞生長因子加快骨缺損修復(fù)速度的研究中，BMP-2是應(yīng)用最多的一種生長因子，且其效果也最好。Urist等[4]報道BMP/磷酸三鈣植入肌肉內(nèi)其

誘導(dǎo)的新骨量比單用BMP大12倍，表明BMP借助載體緩慢釋放，不斷作用于靶細(xì)胞，誘導(dǎo)形成新骨。雖然有動物研究證實，經(jīng)肌肉給予BMP誘導(dǎo)新骨形成是可行的，但是這種治療有潛在的風(fēng)險，如細(xì)胞因子持續(xù)高濃度表達(dá)有可能引發(fā)細(xì)胞分裂失控，機體組織有惡變的危險[5]。Wijdicks等[6]將BMP-2經(jīng)皮注射促進骨缺損修復(fù)，同樣發(fā)現(xiàn)BMP有明顯成骨作用。目前研究的熱點是將BMP-2與載體復(fù)合，組成釋放系統(tǒng)來促進骨缺損修復(fù)。Young等[7]采用納米微球技術(shù)使載體和BMP-2復(fù)合，將BMP-2-PLA-Ns制備成凝膠研究，用于促進骨缺損修復(fù)的愈合。

制備納米微球的包裹載體材料，不但要具有良好的生物降解性及相容性，還要具有很好的載藥能力。通過載體材料在體內(nèi)的降解，實現(xiàn)納米微球的緩釋作用。制備納米微球的包裹材料目前最常用的有PLA和殼聚糖等。本研究采用接枝聚合的方法改進PLA存在親水性和細(xì)胞黏附性的缺陷[8]，運用超聲乳化法制備PLA-Ns凝膠和BMP-2-PLA-Ns凝膠。

3.2 BMP-2-PLA-Ns凝膠的優(yōu)點

PLA作為BMP-2的包裹載體，植入到缺損區(qū)內(nèi)，通過細(xì)胞生長因子的緩釋作用，達(dá)到細(xì)胞生長因子在缺損區(qū)持續(xù)以零級速度釋放，在體內(nèi)刺激成骨細(xì)胞增殖、分化，促進缺損區(qū)新骨的形成，同時其降解周期與新骨形成基本同步[9]。本研究表明：BMP-2

的緩釋能夠很好地誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，從而有效地促進新骨形成。將改性的PLA作為支架材料，制備成BMP-2-PLA-Ns凝膠，可以加速新骨的形成，促進頜骨缺損區(qū)愈合，在成骨方面有一定的優(yōu)越性。影像學(xué)觀察可見，實驗組促進骨愈合以及新骨形成的效果最佳。免疫組織化學(xué)染色研究結(jié)果提示，在第1、2周實驗組PCNA陽性細(xì)胞要優(yōu)于對照組和空白組，但4周時各組PCNA陽性細(xì)胞均罕見，這可能是由于增殖細(xì)胞數(shù)量滿足骨折修復(fù)需要后，分化就成為細(xì)胞的主要活動。

本研究表明：BMP-2-PLA-Ns緩釋凝膠可以加速兔下頜骨缺損區(qū)的新骨形成，促進愈合，但今后還需要進一步解決微球釋放與骨缺損修復(fù)的同步問題，以及PLA降解產(chǎn)物為酸性對組織愈合的影響等。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Miyazono K， Kamiya Y， Morikawa M. Bone morphogenetic protein

receptors and signal transduction[J]. J Biochem， 2010， 147（1）：

35-51.

[2] Li R， Stewart DJ， von Schroeder HP， et al. Effect of cell-based

VEGF gene therapy on healing of a segmental bone defect[J]. J

Orthop Res， 2009， 27（1）：8-14.

[3] Kumar S， Wan C， Ramaswamy G， et al. Mesenchymal stem cells

expressing osteogenic and angiogenic factors synergistically en-

hance bone formation in a mouse model of segmental bone defect

[J]. Mol Ther， 2010， 18（5）：1026-1034.

[4] Urist MR， Lietze A， Dawson E. Beta-tricalcium phosphate deli-

very system for bone morphogenetic protein[J]. Clin Orthop Relat

Res， 1984（187）：277-280.

[5] Guo HF， Shao HY， Yang ZY， et al. Substituted benzothiophene

or benzofuran derivatives as a novel class of bone morphogenetic

protein-2 up-regulators： Synthesis， structure-activity relationships，

and preventive bone loss efficacies in senescence accelerated mice

（SAMP6） and ovariectomized rats[J]. J Med Chem， 2010， 53（4）：

1819-1829.

[6] Wijdicks CA， Virdi AS， Sena K， et al. Ultrasound enhances re-

combinant human BMP-2 induced ectopic bone formation in a rat

model[J]. Ultrasound Med Biol， 2009， 35（10）：1629-1637.

[7] Young S， Patel ZS， Kretlow JD， et al. Dose effect of dual deli-

very of vascular endothelial growth factor and bone morphogenetic

protein-2 on bone regeneration in a rat critical-size defect model

[J]. Tissue Eng Part A， 2009， 15（9）：2347-2362.

[8] Rasal RM， Janorkar AV， Hirt DE. Poly（lactic acid） modifications

[J]. Prog Polym Sci， 2010， 35（3）：338-356.

[9] Wang L， Huang Y， Pan K， et al. Osteogenic responses to different

concentrations/ratios of BMP-2 and bFGF in bone formation[J]. Ann

Biomed Eng， 2010， 38（1）：77-87.

（本文編輯 李彩）