李受益　蔡慶義　陳剛　朱曉虹　鐘曉敏　彭德瑞

[摘要] 目的 以血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和血小板衍生生長因子（PDGF）復(fù)合同軸雙層聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）支架并包裹股動靜脈血管束，觀察血管再生與成熟及支架早期血管化的動態(tài)變化。方法 將18只3月齡成年

雄性新西蘭大耳兔隨機(jī)分為3組：實驗組（8只）、實驗對照組（8只）和空白對照組（2只）。解剖分離兔的股動靜脈血管束，將其包裹于溶液澆鑄-顆粒瀝取法制備的同軸雙層PLGA支架中央。實驗組支架的外層加注PDGF，內(nèi)層加注VEGF；實驗對照組支架的外層為空白，內(nèi)層加注VEGF；空白對照組不予特殊處理。實驗組及實驗對照組于支架植入術(shù)后第7、10、14、21天觀察新生血管的形態(tài)特征，空白對照組于支架植入術(shù)后第7、10天觀察作為對照。結(jié)果 術(shù)后第7天，實驗組及實驗對照組股動靜脈血管束可見少量呈放射狀分布的血管芽；術(shù)后第10天，兩組大量的新生血管芽沿支架孔隙空間向內(nèi)層支架放射狀生長并貫通支架全層，密度由內(nèi)向外梯度遞減；術(shù)后第14天，實驗組血管壁較厚，呈分層結(jié)構(gòu)，實驗對照組以單層內(nèi)皮樣細(xì)胞襯里的幼稚血管為主；術(shù)后第21天，實驗組支架內(nèi)以成熟血管為主，而實驗對照組血管數(shù)量明顯減少?？瞻讓φ战M始終未見明顯血管結(jié)構(gòu)。結(jié)論 同軸雙層PLGA支架復(fù)合VEGF/PDGF可有效促進(jìn)早期血管化。

[關(guān)鍵詞] 骨組織工程； 血管化； 動靜脈血管束； 血管新生

[中圖分類號] Q 81 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.022

組織工程骨因具有無抗原性、來源不受限制、可預(yù)先設(shè)計塑形和具有生物功能等獨特優(yōu)勢，而具有廣闊的發(fā)展前景。但如何提高并確保骨組織工程的早期血管化，迄今仍是影響其規(guī)?；皩嵱眯缘钠款i之一[1-3]。組織工程血管化的關(guān)鍵是功能血管的數(shù)量及其營養(yǎng)能力，而不是僅僅在于成功誘導(dǎo)新生血管的總量。真正有實際價值的早期血管化過程，應(yīng)既能誘導(dǎo)新生血管在支架空間結(jié)構(gòu)內(nèi)大量增殖，又能在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步促進(jìn)其結(jié)構(gòu)成熟以形成穩(wěn)定有效的血循系統(tǒng)[4]。本研究設(shè)計同軸雙層聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]支

架，將血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血小板衍生生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）分別復(fù)合于內(nèi)外層支架形成空間差異分布方式，并將股動靜脈血管束包裹于支架中央，觀察支架內(nèi)部早期誘導(dǎo)血管化的效能及其時間-空間動態(tài)變化與轉(zhuǎn)歸。

1 材料和方法

1.1 同軸雙層PLGA支架的制備

將PLGA（聚乳酸∶聚羥基乙酸為50∶50，相對分子

量50×103，固有黏度0.24 dL·g-1，山東醫(yī)療器械研究所）及粒徑150～300 μm的氯化鈉顆粒混勻溶于氯仿，澆鑄于軸型模具[5]內(nèi)，按溶液澆鑄-顆粒瀝取法[6]制備大小兩套中空管狀支架各18套，套迭形成雙層結(jié)構(gòu)。Co60 25 kGy輻照滅菌，-20 ℃保存。

1.2 股動靜脈血管束分離及支架植入

將18只3月齡成年雄性新西蘭大耳兔（天津醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，體重2.0～2.5 kg）隨機(jī)分為3組：實驗組（8只）、實驗對照組（8只）和空白對照組（2只）。全身麻醉下于兔左側(cè)大腿內(nèi)側(cè)中份縱行解剖游離股動靜脈血管束，結(jié)扎分支，顯露約2.5 cm，包裹于植入體內(nèi)的同軸雙層PLGA支架的中央管腔內(nèi)。根據(jù)分組，實驗組雙層軸型PLGA支架的外層用微量注射器加注含PDGF 0.5 ng的溶液50 μL，內(nèi)層加注含VEGF 0.5 ng的溶液50 μL；實驗對照組的支架外層為空白，僅在內(nèi)層加注含VEGF 0.5 ng的溶液50 μL；空白對照組植入支架不予特殊處理。將支架與毗鄰肌肉縫合固定，分層嚴(yán)密縫合。

1.3 標(biāo)本取材及檢測

實驗組及實驗對照組分別于支架植入后第7、10、14、21天各取2只動物處死，切取包含支架周緣5 mm肌肉組織在內(nèi)的完整組織塊。-20 ℃直接冰凍包埋后行7 μm切片及蘇木精-伊紅（hematine-eosin，HE）染色，觀察新生血管的形態(tài)特征。空白對照組于支架植入術(shù)后第7、10天各取1只動物，進(jìn)行對比觀察。

2 結(jié)果

術(shù)后第7天，實驗組（圖1A）與實驗對照組（圖1B）表現(xiàn)相近，均可見VEGF誘導(dǎo)下，股動靜脈血管外壁向內(nèi)層支架多孔間隙內(nèi)呈放射分布方式，長入條索狀新生組織，周圍植床組織亦可見少量纖維樣組織長入外層支架孔隙，新生組織分布以內(nèi)、外層支架表淺區(qū)域為主。高倍鏡下股動靜脈血管束可見少量由單層內(nèi)皮樣細(xì)胞襯里的幼稚血管芽?？瞻讓φ战M（圖1C）僅見少量纖維組織，未見明顯血管結(jié)構(gòu)。

術(shù)后第10天，實驗組（圖2A、B）、實驗對照組

（圖2C、D）標(biāo)本可見大量新生血管芽廣泛長入支架

內(nèi)部，沿支架孔隙空間向內(nèi)層支架放射狀生長，走行呈迂曲狀，貫穿支架內(nèi)外全層，血管外周的纖維結(jié)締組織基質(zhì)豐富，新生血管密度由內(nèi)層支架表面向外梯度遞減。兩組對比可見，實驗組近外層支架

（PDGF）區(qū)域內(nèi)新生血管的管徑較粗且管壁較厚，腔

內(nèi)聚集血細(xì)胞，近內(nèi)層支架（VEGF）區(qū)域內(nèi)的血管則以單層內(nèi)皮樣細(xì)胞襯里的幼稚血管結(jié)構(gòu)為主，內(nèi)含少量血細(xì)胞；實驗對照組仍多為單層內(nèi)皮樣細(xì)胞襯里的幼稚血管?？瞻讓φ战M（圖2E）僅見少量纖維組織，未見明顯血管結(jié)構(gòu)。

術(shù)后第14天，實驗組（圖3A、B）標(biāo)本可見雙層支架腔隙內(nèi)廣泛分布新生血管網(wǎng)絡(luò)并貫穿全層，其管壁較厚且結(jié)構(gòu)較成熟圓潤，清晰可見逐步過渡的內(nèi)、中、外膜分層，同時可見少量幼稚血管。實驗對照組（圖3C、D）則以單層內(nèi)皮樣細(xì)胞襯里、形狀

較不規(guī)則的幼稚血管為主，成熟血管相對較少。

術(shù)后第21天，實驗組、實驗對照組血管密度均降低，實驗組支架內(nèi)以成熟血管為主（圖4A），沿新生血管軸的縱剖面尚可見血管芽（圖4B）或豐富分支架構(gòu)，管腔內(nèi)含有大量的血細(xì)胞，支架內(nèi)可見少量血細(xì)胞。實驗對照組（圖4C、D）管徑較粗的血管數(shù)量較實驗組明顯減少，支架內(nèi)可見大量散逸的血細(xì)胞。

3 討論

皮膚、軟骨及角膜等少數(shù)組織細(xì)胞可通過周圍血管的擴(kuò)散而得到充分的氧氣和養(yǎng)分[3]。但這種擴(kuò)散

能力僅限于血管周圍200 μm范圍之內(nèi)。對于骨、肌肉等較大工程組織的成功應(yīng)用，血管化問題尚待進(jìn)一步解決[7]。當(dāng)組織工程支架植入體內(nèi)時，雖因手術(shù)

創(chuàng)傷引起的炎癥反應(yīng)和支架內(nèi)部種子細(xì)胞在缺氧條件下釋放的成血管因子可共同誘導(dǎo)支架血管化，但此方式形成血管的速度較慢，無法轉(zhuǎn)運(yùn)充分的氧氣和養(yǎng)分至支架內(nèi)部的種子細(xì)胞。因此學(xué)者[4]通過改變

支架構(gòu)型設(shè)計、復(fù)合誘導(dǎo)血管再生細(xì)胞因子、體內(nèi)外預(yù)血管化等方式促進(jìn)工程組織的血管化進(jìn)程。

誘導(dǎo)骨組織工程血管化的關(guān)鍵是要形成結(jié)構(gòu)成熟、功能穩(wěn)定、能夠長期提供血運(yùn)的循環(huán)系統(tǒng)，因此，血管新生應(yīng)包括兩方面：內(nèi)皮細(xì)胞的遷徙、增殖及周細(xì)胞維持新生血管芽的穩(wěn)定[8]。只有依靠早期

形成的有效血循網(wǎng)絡(luò)，方可在組織工程支架內(nèi)，為受控的組織細(xì)胞分化增殖及最終形成具有預(yù)期形態(tài)及功能的組織/器官提供有效的供氧/供養(yǎng)功效。

Richardson等[9]認(rèn)為VEGF在血管化早期促進(jìn)血

管新生，PDGF在血管化后期誘導(dǎo)血管成熟，聯(lián)合應(yīng)用這兩種因子將能更好地促進(jìn)血管的再生與成熟。在組織工程領(lǐng)域，構(gòu)建一個具有復(fù)雜功能的組織，其關(guān)鍵是要精確地協(xié)調(diào)好干細(xì)胞所處微循環(huán)環(huán)境的時間及空間變化。本研究中，將股動靜脈血管束包裹于構(gòu)建的同軸雙層PLGA支架中央作為軸型血供來源，通過在其外層復(fù)合PDGF、內(nèi)層復(fù)合VEGF的設(shè)計方式，使兩種分別作用在血管形成不同時期的誘導(dǎo)因子利用空間分布的差異方式，形成對血管組織誘導(dǎo)再生的時間差異效應(yīng)。VEGF接近股動靜脈，利于早期誘導(dǎo)大量血管芽生及幼稚血管生成。PDGF位居外層，利于促進(jìn)后期放射狀向外生長，并促進(jìn)最終與周圍組織血循溝通的新生血管結(jié)構(gòu)的成熟與穩(wěn)定。事實上，這種后期的血管成熟與穩(wěn)定，才是真正有意義的支架血管化的組織結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。與此同時，在外層管壁支架上的PDGF，還依賴滲透方式逐步作用于較靠內(nèi)的新生血管叢，使之最終穩(wěn)定下來。

本研究結(jié)果顯示，實驗組第10天時，隨著兩種因子在雙層支架內(nèi)部逐漸形成的不同濃度梯度，由外層支架到內(nèi)層支架可見新生血管由成熟到幼稚。第21天時，實驗對照組新生血管密度較前明顯降低。動靜脈血管束早期在VEGF的誘導(dǎo)下，支架內(nèi)部形成大量的幼稚血管，這些幼稚血管成熟之前在VEGF的持續(xù)作用下可以避免退化及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。但隨著VEGF的逐步降解，新生的幼稚血管急劇退化而大量血細(xì)胞殘存于支架內(nèi)部。實驗組早期在VEGF誘導(dǎo)下大量新生幼稚血管伴隨纖維組織貫穿雙層支架，后期在PDGF作用下，幼稚血管逐漸改建成熟，雖然VEGF和PDGF不斷降解，但僅少部分未成熟的新生血管逐漸退化，最終形成貫通雙層支架內(nèi)部的成熟穩(wěn)定的循環(huán)網(wǎng)絡(luò)。

在VEGF及其他成血管因子的誘導(dǎo)下，內(nèi)皮細(xì)胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶降解周圍的細(xì)胞外基質(zhì)，內(nèi)皮細(xì)胞增殖并向高濃度因子部位遷徙[10]，內(nèi)皮細(xì)胞遷

徙至降解后形成的腔隙最終形成新生血管。其過程受黏附蛋白、生長因子、連接分子、內(nèi)源性抑制分子等的聯(lián)合作用[11]。新生血管進(jìn)一步改建為成熟血

管則需要多種功能不同因子之間的相互作用[10]，但

是Greenberg等[12]發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)組織工程血管化過程中

聯(lián)合應(yīng)用VEGF和PDGF并不能獲得持久的血管效應(yīng)，認(rèn)為VEGF受體2抑制PDGF受體β信號通路，進(jìn)而干擾血管平滑肌功能及血管成熟。關(guān)于不同因子之間的協(xié)調(diào)機(jī)制，尚須從分子層面及細(xì)胞信號通路方面等進(jìn)一步研究。

本研究表明：同軸雙層PLGA支架構(gòu)建方式可顯著改善組織工程支架內(nèi)部的早期血運(yùn)環(huán)境，提高氧氣和養(yǎng)分的輸送效能。

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（本文編輯 李彩）