曹春暉，孫世春，麥康森，梁 英

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266003；2. 天津科技大學(xué)天津市海洋資源與化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457)

微藻具有生化合成高度不飽和脂肪酸(highly unsaturated fatty acids，HUFAs)的能力，因此被作為二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等(n-3)HUFAs的新來(lái)源而受到廣泛重視．微藻可作為浮游動(dòng)物(輪蟲(chóng)、枝角類等)、甲殼類、雙殼類和幼齡魚(yú)類的餌料而在海水養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位．對(duì)許多海產(chǎn)動(dòng)物來(lái)說(shuō)，餌料中含有豐富的魚(yú)蝦類生長(zhǎng)所必需的脂肪酸(essential fatty acids，EFA)尤其是 EPA 和DHA，能夠提高其生長(zhǎng)率和幼體的存活率．HUFAs對(duì)人體也有非常重要的生理作用，可防治多種心血管疾病，促進(jìn)兒童智力及心理發(fā)育．

微藻的脂肪含量以及脂肪酸構(gòu)成的數(shù)量和質(zhì)量都可因環(huán)境因子而改變[1–2]．微藻在不同生長(zhǎng)時(shí)期脂肪酸組成和含量差別很大，(n-3)HUFAs的產(chǎn)量可因在藻類生長(zhǎng)的特殊時(shí)期進(jìn)行收獲而達(dá)到最大值．關(guān)于生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)微藻脂肪含量和脂肪酸組成的影響已有多個(gè)報(bào)道[3–10]，但國(guó)內(nèi)外對(duì)裂絲藻的研究則未見(jiàn)報(bào)道．本文對(duì) 1株裂絲藻和 3株小球藻共 4株綠藻在不同生長(zhǎng)時(shí)期培養(yǎng)時(shí)其脂肪含量和脂肪酸組成進(jìn)行了測(cè)定，以期找出其生長(zhǎng)和脂肪酸合成的最適條件，為微藻的不飽和脂肪酸研究提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 藻種

實(shí)驗(yàn)所用微藻藻種取自中國(guó)海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫(kù)(MACC)：小球藻 Chlorella spp. MACC/C95、MACC/C97、MACC/C102和桿狀裂絲藻Stichococcus bacillaris MACC/C19．

1.2 培養(yǎng)條件

對(duì) 4株藻種作不同生長(zhǎng)時(shí)期(指數(shù)期、穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期)的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)．其中海水經(jīng)沉淀后用脫脂棉過(guò)濾，煮沸消毒．采用f/2培養(yǎng)基．實(shí)驗(yàn)于2,L細(xì)口瓶中進(jìn)行，連續(xù)充氣，連續(xù)光照(4,500,lx)，培養(yǎng)液鹽度為 28‰，室溫(20±1)℃．每天用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度．

1.3 微藻收獲

微藻在指數(shù)生長(zhǎng)末期至穩(wěn)定前期 4,000,r/min離心收獲，真空干燥．

1.4 脂肪測(cè)定

采用索氏抽提法．

1.5 脂肪酸分析

樣品處理及氣相色譜分析按文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行.取 40,mg樣品于離心管中，加入體積比為 2∶1的氯仿和甲醇溶液 10,mL，振蕩后加入 2,mol/L的NaOH/CH3OH 溶液 1,mL，充分振蕩，75,℃水浴加熱15,min進(jìn)行皂化，冷卻后加入 2,mol/L 的HCl/CH3OH 溶液，調(diào)節(jié) pH≤2，在 75,℃水浴中加熱15,min，使其甲酯化，然后加入 1,mL的正己烷振蕩，取上清液進(jìn)行色譜分析．

氣相色譜分析采用美國(guó) HP5890Ⅱ型氣相色譜儀，氫火焰離子化檢測(cè)器，Coawax carbowax毛細(xì)管柱(30,m×0.25,mm)，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度均為280,℃，程序升溫，載氣為高純氮，流量2,mL/min，進(jìn)樣量1,μL．以面積歸一法得到各脂肪酸組分的相對(duì)含量．各個(gè)脂肪酸的鑒定通過(guò)比較實(shí)驗(yàn)樣品色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖以及各脂肪酸的出峰時(shí)間來(lái)進(jìn)行．

1.6 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)差及單因子方差分析由 Excel軟件處理分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示．

2 結(jié)果與分析

2.1 脂肪含量

不同生長(zhǎng)時(shí)期對(duì) 4株綠藻的脂肪含量的影響見(jiàn)表 1．結(jié)果表明，生長(zhǎng)時(shí)期對(duì) 4株綠藻的脂肪含量影響顯著(P＜0.05)．從表 1可以看出：C19、C95和C97的脂肪含量隨生長(zhǎng)時(shí)期的延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)．C19的脂肪含量在穩(wěn)定后期達(dá)到最大值(33.7%)；C95和C97的脂肪含量在指數(shù)期和穩(wěn)定前期之間隨生長(zhǎng)時(shí)期的延長(zhǎng)顯著增加，而在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期之間增長(zhǎng)緩慢(分別為 16.6%～19.2%和 27.7%～32.1%)；C102的脂肪含量在指數(shù)期和穩(wěn)定前期之間呈增加趨勢(shì)，并在穩(wěn)定前期獲得脂肪含量的最大值(28.1%)，之后則隨生長(zhǎng)時(shí)期的延長(zhǎng)有所下降．

2.2 脂肪酸組成

不同生長(zhǎng)時(shí)期(指數(shù)期、穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期)對(duì)4株綠藻脂肪酸組成的影響見(jiàn)表 2．結(jié)果表明：16∶0(19.5%～39.8%)，16∶1(n-7)(21.9%～32.9%)，18∶1(n-9)(3.1%～14.7%)，20∶4(n-6)(1.9%～4.8%)和EPA(6.7%～28.4%)是 4株綠藻的主要脂肪酸成分，生長(zhǎng)時(shí)期對(duì) 4株綠藻的主要脂肪酸成分含量影響顯著(P＜0.05)．

表2 不同生長(zhǎng)時(shí)期4株綠藻的主要脂肪酸組成Tab.2 Fatty acid compositions in the four strains of green algae at different growing phases %

由表2可以看出：4株綠藻的脂肪酸組成和含量隨生長(zhǎng)時(shí)期變化較大．裂絲藻 C19和 3株小球藻C95、C97和 C102中的 EPA含量均在指數(shù)期最高，分別可達(dá)17.3%、28.1%、28.4%和14.8%．C19的20∶4(n-6)含量在各生長(zhǎng)時(shí)期保持穩(wěn)定，16∶1(n-7)在穩(wěn)定前期含量最低，而在指數(shù)期和穩(wěn)定后期含量較大．16∶0含量隨生長(zhǎng)時(shí)期而增加，14∶0則在各生長(zhǎng)時(shí)期變化不明顯．

小球藻 C95的 20∶4(n-6)、18∶3(n-3)和 16∶1(n-7)含量隨生長(zhǎng)時(shí)期的延長(zhǎng)而減少，而 18∶1(n-9)、16∶0、14∶0含量則隨生長(zhǎng)時(shí)期的延長(zhǎng)而增加，在指數(shù)期和穩(wěn)定前期有極低的 DHA含量．C97的14∶0和 16∶1(n-7)含量在各生長(zhǎng)時(shí)期基本穩(wěn)定，16∶0和 18∶1(n-9)含量在指數(shù)期和穩(wěn)定前期較為穩(wěn)定，而在穩(wěn)定后期有顯著增加．18∶3(n-3)含量在穩(wěn)定前期含量較低，而在指數(shù)期和穩(wěn)定后期較高．20∶4(n-6)含量在指數(shù)期和穩(wěn)定前期較為穩(wěn)定，而在穩(wěn)定后期明顯降低．18∶1(n-7)在穩(wěn)定前期有較多含量(4.0%)，而在穩(wěn)定后期降為 0.1%，指數(shù)期未檢出．C102的 20∶4(n-6)含量在指數(shù)期較高，在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期含量降低．18∶3(n-3)含量在穩(wěn)定前期最低，而在指數(shù)期和穩(wěn)定后期都會(huì)增加．16∶1(n-7)含量在各生長(zhǎng)時(shí)期保持穩(wěn)定，16∶0含量隨生長(zhǎng)時(shí)期的延長(zhǎng)而增加，14∶0含量則隨生長(zhǎng)時(shí)期的延長(zhǎng)而降低．

C19的單不飽和脂肪酸(MUFA)總量在各生長(zhǎng)時(shí)期變化不大，飽和脂肪酸(SFA)總量則隨生長(zhǎng)時(shí)期的延長(zhǎng)略有增加，HUFAs含量在指數(shù)期較高，而在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期含量降低但較為穩(wěn)定．C95和C97的SFA總量隨收獲期的延長(zhǎng)而有顯著增加，C102的SFA含量隨生長(zhǎng)時(shí)期呈升高趨勢(shì)．C95的MUFA總量在各生長(zhǎng)時(shí)期保持穩(wěn)定，C97的 MUFA在指數(shù)期和穩(wěn)定前期保持穩(wěn)定，而到穩(wěn)定后期有顯著升高，C102的MUFA在指數(shù)期含量較低，而在穩(wěn)定前期和穩(wěn)定后期有明顯升高且保持穩(wěn)定．3株小球藻 C95、C97、C102的多不飽和脂肪酸含量HUFAs總量隨收獲時(shí)期的延長(zhǎng)而有明顯的降低．

3 討 論

在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，4株綠藻的主要脂肪酸組成為14∶0、16∶0、16∶1(n-7)、18∶1(n-9)、18∶3(n-3)、20∶4(n-6)和 EPA，DHA含量很少或不含，符合綠藻綱的脂肪酸特征[11–12]．4株綠藻的脂肪含量均隨生長(zhǎng)時(shí)期的延長(zhǎng)而增加，表明脂肪在穩(wěn)定期積累．有報(bào)道[13–14]認(rèn)為細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期后，培養(yǎng)基中氨基酸合成所必需的氮減少了，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成量降低，光合作用所同化的碳進(jìn)入到碳水化合物和脂肪中，出現(xiàn)能量積累的趨勢(shì)．Mansour等[9]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gymnodinium sp.的脂肪含量在穩(wěn)定期(第 43天)比指數(shù)期(第 6天)時(shí)提高了 30倍．魏東等[15]對(duì)Ellipsoidion sp.和 Nannochloropsis oculata 的研究結(jié)果也表現(xiàn)出了相同的規(guī)律．

研究結(jié)果顯示指數(shù)期 HUFAs含量較高，這是由于指數(shù)期藻細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，光合效率高，類囊體數(shù)量及表面積增加，極性甘油脂(含有較多的HUFA)作為類囊體膜的主要組分，其含量相應(yīng)升高[16]．Piorreck等[17]通過(guò)對(duì)小球藻Chlorella vulgaris的研究指出，綠藻的脂肪酸組成及含量隨生長(zhǎng)時(shí)期而改變，在生長(zhǎng)起始階段綠藻能產(chǎn)生大量的極性脂肪和16碳、18碳多不飽和脂肪酸，而生長(zhǎng)后期，綠藻的主要脂肪變?yōu)橹行郧襇UFA和SFA的含量大增．Liang等[5–6]報(bào)道了Chaetoceros gracilis(MACC/B13)、Cylindrotheca fusiformis(MACC/B211)、Phaeodactylum tricornutum(MACC/B221)和 Nitzschia closterium (MACC/B222)的HUFAs和EPA含量在指數(shù)期最高，隨生長(zhǎng)時(shí)期的延長(zhǎng)其含量減少；4株筒柱藻 Cylindrotheca(B156、B164、B196、B200)的 HUFAs均在指數(shù)期或穩(wěn)定前期達(dá)到高峰．Fidalgo等[7]的研究結(jié)果表明 Isochrysis galbana的 HUFAs含量在穩(wěn)定前期達(dá)到最大值，隨后在穩(wěn)定期逐漸降低．Lin等[8]的結(jié)果表明I.,galbana CCMP 1324的SFA、MUFA以及HUFA含量均在穩(wěn)定前期達(dá)到最大值．李文權(quán)等[10]的結(jié)果表明I.,galbana、Dunaliella salina 和 Chlorella sp.的總多不飽和脂肪酸(THUFA)含量在指數(shù)期明顯高于穩(wěn)定期，其中 D.,salina 的 18∶3(n-3)、Chlorella sp.的EPA和I.,galbana的DHA含量均在指數(shù)期達(dá)到最大值．本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4株綠藻的EPA和HUFAs含量均隨生長(zhǎng)時(shí)期的延長(zhǎng)而下降，C19、C95和C102中的 EPA含量在指數(shù)期達(dá)到最大值，C97在指數(shù)期和穩(wěn)定前期 EPA 含量較高，穩(wěn)定后期顯著降低；C19、C95、C97和C102的HUFAs含量均在指數(shù)期達(dá)到最大值，與上述結(jié)果一致．

生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)微藻脂肪酸的影響因種而異．三酰甘油含量高的藻類中含有相對(duì)高比例的飽和脂肪酸及單烯酸，而 HUFA 較少[4,18–20]．Fernández-Reiriz等[3]報(bào)道了生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)微藻的 EPA和 DHA影響因種而異．Mansour等[9]的結(jié)果表明 Gymnodinium sp.的18∶5(n-3)和 EPA 隨培養(yǎng)時(shí)間而減少，而 DHA 含量隨培養(yǎng)時(shí)間增加．Dustan等[4]報(bào)道了 N.,oculata在指數(shù)期 HUFAs相對(duì)含量最高，Pavlova lutheri在穩(wěn)定前期 HUFAs相對(duì)含量最高，而 Isochrysis sp.的HUFAs含量隨生長(zhǎng)時(shí)期變化不明顯．Hopley等[21]也報(bào)道了C.,vulgaris(CCAP211/8,K)和(CCAP211/11C)的脂肪酸組成在指數(shù)期和穩(wěn)定期沒(méi)有明顯的變化．

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