吳大勇 WU Dayong

張文艷 ZHANG Wenyan

邊艷珠 BIAN Yanzhu

胡玉敬 HU Yujing

家兔下腔靜脈血栓99Tc m -膜聯(lián)蛋白Ⅴ顯像的實(shí)驗(yàn)研究

吳大勇 WU Dayong

張文艷 ZHANG Wenyan

邊艷珠 BIAN Yanzhu

胡玉敬 HU Yujing

目的探討99Tcm-膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）進(jìn)行靜脈血栓顯像及鑒別新鮮與陳舊靜脈血栓的可行性。材料與方法將15只家兔隨機(jī)平均分為新鮮血栓組、陳舊血栓組及對(duì)照組，每組5只，新鮮血栓組及陳舊血栓組通過手術(shù)于下腔靜脈置入螺旋銅絲建立下腔靜脈血栓模型，對(duì)照組建立模型后不在下腔靜脈內(nèi)置入銅絲。新鮮血栓組及對(duì)照組于術(shù)后1 d、陳舊血栓組于術(shù)后14 d注射99Tcm-Annexin Ⅴ，分別于注射后30、60、90 min及2 h顯像，勾畫感興趣區(qū)，計(jì)算新鮮血栓組及陳舊血栓組血栓與本底放射性計(jì)數(shù)比值，對(duì)照組計(jì)算與血栓組血栓對(duì)應(yīng)的下腔靜脈部位與本底放射性計(jì)數(shù)比值，比較新鮮血栓組與陳舊血栓組、對(duì)照組血栓與本底放射性計(jì)數(shù)比值的差異。顯像結(jié)束后處死實(shí)驗(yàn)兔，留存血栓標(biāo)本行病理檢查。結(jié)果新鮮血栓組5只實(shí)驗(yàn)兔血栓部位均呈放射性濃聚影，陳舊血栓組5只實(shí)驗(yàn)兔血栓部位均未見放射性濃聚表現(xiàn)，對(duì)照組5只實(shí)驗(yàn)兔下腔靜脈均未見放射性濃聚；新鮮血栓組血栓與本底放射性計(jì)數(shù)比值（4.06±0.49）高于陳舊血栓組（2.46±0.38）及對(duì)照組對(duì)應(yīng)的下腔靜脈部位與本底放射性計(jì)數(shù)比值（2.27±0.24）（t=5.746、7.318, P＜0.05）；新鮮血栓組血栓病理結(jié)果提示為新鮮混合血栓，陳舊血栓組血栓為機(jī)化混合血栓。結(jié)論99Tcm-Annexin Ⅴ有望成為一種新的急性新鮮靜脈血栓顯像劑用于鑒別新鮮與陳舊靜脈血栓。

靜脈血栓栓塞；腔靜脈，下；體層攝影術(shù)，發(fā)射型計(jì)算機(jī)，單光子；有機(jī)锝化合物；膜聯(lián)蛋白質(zhì)類；造影劑；疾病模型，動(dòng)物；兔

深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis, DVT）是導(dǎo)致肺動(dòng)脈血栓栓塞（pulmonary thromboembolism, PTE）的主要原因，51%～71%的下肢DVT可能會(huì)發(fā)生PTE[1]。然而，PTE缺乏典型的臨床表現(xiàn)，其漏診率及病死率高，約60%的致死性PTE患者被漏診[2]。急性深靜脈血栓為新鮮混合血栓，其中白色血栓富含活化血小板，活化后的血小板膜表面暴露磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine, PS）[3]，膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）能夠特異性地結(jié)合PS[4]。形成時(shí)間較長的深靜脈陳舊血栓發(fā)生機(jī)化，活化血小板數(shù)量明顯減少。本實(shí)驗(yàn)利用99Tcm-Annexin Ⅴ分別對(duì)家兔新鮮及陳舊下腔靜脈血栓模型進(jìn)行顯像，探討其進(jìn)行急性新鮮靜脈血栓顯影及用于鑒別新鮮與陳舊靜脈血栓的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 GE Millennium VG Hawkeye SPECT儀，CAPINTEC CRC-15R型活度儀，北京原子高科提供鉬锝發(fā)生器。Annexin Ⅴ（Bender Medsystems公司），分析純氯化亞錫（天津市化學(xué)試劑三廠），新華1號(hào)濾紙、硅膠快速層析濾紙（北京師范大學(xué)化學(xué)院惠贈(zèng)），分析純丙酮（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)新西蘭家兔15只（購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)1009032），清潔環(huán)境飼料喂養(yǎng)，體重2.0～2.5 kg，平均（2.25±0.25）kg，雌雄不限。將15只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)平均分為新鮮血栓組、陳舊血栓組及對(duì)照組，每組5只。

1.399Tcm-Annexin Ⅴ標(biāo)記 參照文獻(xiàn)[5]報(bào)道的方法，在反應(yīng)瓶中依次加入30 μg Annexin Ⅴ、500 μl檸檬酸葡萄糖溶液、10 mg/ml酒石酸鉀鈉溶液100 μl、10 μl新鮮SnCl2/HCl（2 mg/ml）溶液，充分搖勻，于4℃冰箱冷藏靜置20 min，然后向反應(yīng)瓶中加入1 ml高锝酸鈉（99TcmO4-）溶液（1110 MBq/ml），室溫下靜置20 min，完成標(biāo)記。利用雙體系[新華1號(hào)濾紙為固定相、丙酮為展開劑，硅膠快速層析濾紙（ITLG-SG）為固定相、生理鹽水為展開劑]測(cè)定99Tcm-Annexin Ⅴ標(biāo)記即刻、室溫及37℃恒溫箱下保存1、2、3、4、5、8 h放化純。

1.4 家兔下腔靜脈血栓模型制作 參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道的方法，家兔經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（1.0～1.3 ml/kg）麻醉，將麻醉好的家兔固定在手術(shù)臺(tái)上，右側(cè)腹備皮，于右側(cè)腹部皮膚切開一4～6 cm長切口，鈍性分離肌肉及腹膜，暴露右腎下極以遠(yuǎn)長約4 cm的下腔靜脈，將自制長約3 cm、直徑約2 mm的單股螺旋銅絲穿刺置入下腔靜脈，自制銅絲U形夾于下腔靜脈近心端卡住螺旋銅絲，止血、縫合血管，查看下腔靜脈通暢后，縫合肌肉、皮膚。對(duì)照組家兔建立下腔靜脈血栓模型后，下腔靜脈不置入螺旋銅絲。術(shù)后肌肉注射80萬U青霉素，家兔于清潔環(huán)境飼養(yǎng)。

1.5 顯像方法與圖像分析 新鮮血栓組與對(duì)照組家兔于術(shù)后1 d、陳舊血栓組于術(shù)后14 d進(jìn)行99Tcm-AnnexinⅤ顯像。各組實(shí)驗(yàn)兔于注射后30、60、90、120 min行靜態(tài)平面顯像。實(shí)驗(yàn)兔仰臥于檢查床上，SPECT儀配低能高分辨準(zhǔn)直器，采集能峰：140 keV，窗寬20%。共采集1000K計(jì)數(shù)，矩陣256×256，放大2倍。血栓顯影的實(shí)驗(yàn)兔于血栓顯影最清楚的時(shí)間點(diǎn)圖像勾畫血栓部位和右后肢根部（作為本底）等面積感興趣區(qū)（ROI），未顯影實(shí)驗(yàn)兔于60 min顯像圖像勾畫血栓部位和右后肢根部（作為本底）等面積ROI，計(jì)算靜脈血栓部位與本底放射性計(jì)數(shù)比值。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔于60 min顯像圖像，在與血栓組血栓對(duì)應(yīng)的下腔靜脈部位勾畫ROI，于右后肢根部勾畫等面積的ROI作為本底，計(jì)算對(duì)應(yīng)下腔靜脈部位與本底放射性計(jì)數(shù)比值。

1.6 病理檢查 顯像完畢后處死實(shí)驗(yàn)兔，新鮮血栓組及陳舊血栓組實(shí)驗(yàn)兔取血栓，用生理鹽水沖洗干凈，紗布沾干，置于福爾馬林溶液中固定，然后行HE染色。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件，新鮮血栓組與陳舊血栓組、對(duì)照組血栓與本底放射性計(jì)數(shù)比值比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.199Tcm-Annexin Ⅴ放化純99Tcm-Annexin Ⅴ在標(biāo)記即刻、室溫及37℃恒溫保存2 h內(nèi)放化純均高于95%，保存8 h仍高于90%。

2.2 顯像結(jié)果 新鮮血栓組5只實(shí)驗(yàn)兔下腔靜脈血栓部位均可以觀察到團(tuán)狀放射性濃聚影（圖1），血栓開始顯影的時(shí)間為30～60 min，均為逐漸增濃之后減淡。陳舊血栓組實(shí)驗(yàn)兔血栓部位及對(duì)照組實(shí)驗(yàn)兔下腔靜脈走行區(qū)均未見放射性濃聚（圖2）。新鮮血栓組血栓與本底放射性計(jì)數(shù)比值（4.06±0.49）高于陳舊血栓組（2.46±0.38）及對(duì)照組對(duì)應(yīng)的下腔靜脈部位與本底放射性計(jì)數(shù)比值（2.27±0.24），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.746、7.318, P＜0.05）。

2.3 解剖及病理結(jié)果 新鮮血栓組實(shí)驗(yàn)兔解剖后肉眼均可見下腔靜脈內(nèi)血栓形成，血栓附著于銅絲上，呈紅白相間（圖3A）；血栓病理顯示均為新鮮混合血栓，顯微鏡下可見珊瑚狀淡紅色血小板小梁，紅細(xì)胞分布于小梁間的纖維素網(wǎng)內(nèi)，小梁邊緣黏附有較多的中性粒細(xì)胞（圖3B）。陳舊血栓組實(shí)驗(yàn)兔解剖后肉眼亦均可見血栓形成，血栓沿螺旋銅絲紅白相間，但較新鮮血栓組血栓顏色偏暗（圖3C）；血栓病理顯示均為陳舊機(jī)化的混合血栓，顯微鏡下見珊瑚狀血小板小梁，小梁間隙可見多量內(nèi)皮細(xì)胞分化趨勢(shì)細(xì)胞，小梁間的纖維素網(wǎng)內(nèi)包含少量紅細(xì)胞及較多附著的中性粒細(xì)胞，呈機(jī)化表現(xiàn)（圖3D）。對(duì)照組解剖后下腔靜脈內(nèi)未見血栓形成。

圖1 新鮮血栓組顯像。血栓部位呈放射性濃聚影（箭），逐漸增濃后減淡，注射99Tcm-Annexin Ⅴ后60 min顯影最清晰。A～D分別為注射99Tcm-Annexin Ⅴ后30、60、90、120 min顯影

圖2 陳舊血栓組與對(duì)照組顯像（60 min）。A.陳舊血栓組血栓部位未見放射性濃聚；B.對(duì)照組下腔靜脈未見放射性濃聚

圖3 A、B.新鮮血栓組血栓肉眼（A）及病理鏡下（B）所見，病理示混合血栓，未見機(jī)化表現(xiàn)（HE, ×40）；C、D.陳舊血栓組血栓肉眼（C）及病理鏡下（D）所見，病理示血栓小梁間隙可見多量血管內(nèi)皮細(xì)胞分化趨勢(shì)細(xì)胞，呈機(jī)化表現(xiàn)（HE, ×40）

3 討論

PTE的血栓主要來源于DVT，而PTE的高病死率嚴(yán)重威脅著人類的健康。在西方國家，DVT和PTE的每年發(fā)病率分別為0.1%和0.05%[7]。急性靜脈血栓主要為新鮮混合血栓，其中混合血栓內(nèi)的白色血栓部分富含活化的血小板；而形成時(shí)間較長的靜脈陳舊混合血栓多發(fā)生機(jī)化，血栓內(nèi)活化的血小板明顯減少。新鮮靜脈血栓較陳舊機(jī)化血栓脫落的風(fēng)險(xiǎn)更大，因此對(duì)于急性新鮮靜脈血栓應(yīng)采取積極的溶栓治療，兩者的鑒別對(duì)于臨床制訂治療計(jì)劃具有重要意義[8]。

根據(jù)與活化血小板結(jié)合的機(jī)制不同，血栓活化血小板顯像劑主要有與GPⅡbⅢa受體結(jié)合、與P-選擇素結(jié)合、與PS結(jié)合3類[9]。與GPⅡbⅢa受體結(jié)合的顯像劑研究較多[10,11]。Ji等[12]利用99Tcm標(biāo)記國內(nèi)自行研制的P-選擇素單克隆抗體SZ-51，成功地對(duì)新鮮動(dòng)脈、下肢深靜脈及肺動(dòng)脈血栓進(jìn)行顯像，但多肽及單克隆抗體制備成本高，其應(yīng)用受到一定的限制。與PS結(jié)合的血栓顯像劑主要為99Tcm-Annexin Ⅴ，它能夠與活化的血小板表面暴露的PS結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)血栓進(jìn)行顯像。

本實(shí)驗(yàn)觀察到下腔靜脈造模術(shù)后1 d左右的新鮮血栓組5只實(shí)驗(yàn)兔99Tcm-Annexin Ⅴ顯像血栓均顯影，新鮮血栓組下腔靜脈血栓/本底放射性計(jì)數(shù)比值為4.06±0.49，具有較高的靶本比，血栓能夠清晰地顯像。新鮮血栓組血栓經(jīng)病理證實(shí)為新鮮混合血栓。形成時(shí)間長的靜脈陳舊混合血栓多發(fā)生機(jī)化，血栓活化的血小板明顯減少，血栓血小板表面暴露的PS減少。因此，陳舊靜脈血栓攝取99Tcm-Annexin Ⅴ明顯減少。本實(shí)驗(yàn)中血栓形成14 d的陳舊血栓組血栓均未見顯影，血栓經(jīng)病理證實(shí)為陳舊機(jī)化血栓。

99Tcm-Annexin Ⅴ用于急性左心房血栓[13]、腹主動(dòng)脈瘤附壁血栓[14]、感染性心內(nèi)膜炎血栓性贅生物[15]、新鮮動(dòng)脈血栓[16]顯像的研究已有報(bào)道，以上研究的血栓均形成于動(dòng)脈血液。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，活化的血小板較動(dòng)脈血栓少的新鮮靜脈血栓利用99Tcm-Annexin Ⅴ顯像能夠顯影。本實(shí)驗(yàn)所得平均血栓/本底放射性計(jì)數(shù)比值較Sarda-Mantel等[14]研究得到的大鼠腹主動(dòng)脈瘤模型附壁血栓/本底放射性計(jì)數(shù)比值（SPECT: 5.7±0.9）低，可能是因?yàn)楦怪鲃?dòng)脈瘤附壁血栓形成于動(dòng)脈血液，血栓內(nèi)活化的血小板數(shù)量多，攝取99Tcm-Annexin Ⅴ多，而且斷層顯像比靜態(tài)平面顯像受重疊組織干擾少。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)所得平均血栓反斜線本底放射性計(jì)數(shù)比值均高于賈支俊等[17]、呂中偉等[18]報(bào)道的股動(dòng)脈血栓/本底放射性計(jì)數(shù)比值（分別為3.13、3.68），可能與血栓形成的血管部位、時(shí)間長短及感興趣區(qū)勾畫部位不同有關(guān)。

99Tcm-Annexin Ⅴ實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活體顯像中新鮮靜脈血栓能夠顯影，且顯示了良好的血栓/本底放射性計(jì)數(shù)比值，而陳舊靜脈血栓未能顯影，提示99Tcm-Annexin Ⅴ有望成為一種新的急性靜脈血栓顯像劑，用于鑒別新鮮與陳舊靜脈血栓。

[1] 程顯聲, 何建國. 肺栓塞的流行病學(xué). 中國循環(huán)雜志, 1998, 13(2): 65-66.

[2] Heit JA, Cohen AT, Anderson FA. Estimated annual number of incident and recurrent, non-fatal and fatal venous thromboembolism (VTE) events in the US. ASH Annual Meeting, 2005, 106(11): 910.

[3] Vriens PW, Blankenberg FG, Stoot JH, et al. The use of technetium Tc 99m annexin V for in vivo imaging of apoptosis during cardiac allograft rejection. J Thorac Cardiovasc Surg, 1998, 116(5): 844-853.

[4] Johnson LL, Schofield L, Donahay T, et al. 99mTc-annexin V imaging for in vivo detection of atherosclerotic lesions in porcine coronary arteries. J Nucl Med, 2005, 46(7): 1186-1193.

[5] Zhu L, Liu BL, Guo YZ. 99Tcm direct labeling of Annexin V for potential apoptosis imaging in vivo. J Labelled Comp Rad, 2003, (z1): S324.

[6] 季順東, 方緯, 范磊, 等.99Tcm標(biāo)記人源化抗人血小板膜糖蛋白Ⅲ a單克隆抗體SZ21F(ab)2血栓栓塞顯像. 中華核醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 27(3): 173-176.

[7] Torbicki A, Van Beek ER, Charbonnier B, et al. Guidelines on diagnosis and management of acute pulmonary embolism. Task Force on Pulmonary Embolism, European Society of Cardiology. Eur Heart J, 2000, 21(16): 1301-1336.

[8] 李曉強(qiáng), 王深明. 深靜脈血栓形成的診斷和治療指南(第2版). 中國醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版), 2013, 50(3): 53-57.

[9] 吳大勇, 邊艷珠. 血栓活化血小板放射性核素顯像研究進(jìn)展. 中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù), 2011, 27(12): 58-61.

[10] 何嘉, 方緯, 王峰, 等.99Tcm-DMP444肺動(dòng)脈血栓與下肢深靜脈血栓顯像的實(shí)驗(yàn)研究. 中華核醫(yī)學(xué)與分子影像雜志, 2012, 32(1): 59-62.

[11] Fang W, He J, Kim YS, et al. Evaluation of 99mTc-labeled cyclic RGD peptide with a PEG4 linker for thrombosis imaging: comparison with DMP444. Bioconjug Chem, 2011, 22(8): 1715-1722.

[12] Ji S, Fang W, Zhu M, et al. Detection of pulmonary embolism with 99mTc-labeled F(ab)2 fragment of anti-P-selectin monoclonal antibody in dogs. Tohoku J Exp Med, 2011, 223(1): 9-15.

[13] Stratton JR, Dewhurst TA, Kasina S, et al. Selective uptake of radiolabeled annexin V on acute porcine left atrial thrombi. Circulation, 1995, 92(10): 3113-3121.

[14] Sarda-Mantel L, Coutard M, Rouzet F, et al. 99mTc-annexin-V functional imaging of luminal thrombus activity in abdominal aortic aneurysms. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26(9): 2153-2159.

[15] Rouzet F, Dominguez Hernandez M, Hervatin F, et al. Technetium 99m-labeled annexin V scintigraphy of platelet activation in vegetations of experimental endocarditis. Circulation, 2008, 117(6): 781-789.

[16] Tait JF, Cerqueira MD, Dewhurst TA, et al. Evaluation of annexin V as a platelet-directed thrombus targeting agent. Thromb Res, 1994, 75(5): 491-501.

[17] 賈支俊, 申景濤, 郭萬華, 等.99Tcm標(biāo)重組H-Annexin Ⅴ在動(dòng)物血栓顯像中的研究. 中華核醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 27(5): 291-294.

[18] 呂中偉, 朱承謨, 李彪, 等.99Tcm-Annexin血栓顯像及其體內(nèi)分布的初步實(shí)驗(yàn)研究. 上海醫(yī)學(xué)影像雜志, 2000, 9(3): 137-139.

（責(zé)任編輯 張春輝）

99Tc m -Annexin ⅤScintigraphy of Inferior Vena Cava Thrombus in Rabbits

PurposeTo explore the features of99Tcm-Annexin Ⅴ scintigraphy of venous thrombus and its feasibility of discriminating fresh venous thrombus from old one.Materials andMethodsThe rabbits (n=15) were randomly divided into three groups (fresh thrombus group, old thrombus group and control group). The inferior vena cava thrombus models were developed in the rabbits of thrombus groups by inserting screw cooper wire into inferior vena cava. The rabbits of control group received sham operation.99Tcm-Annexin Ⅴ was injected in the rabbits of fresh thrombus group and control group one day after operation; the same was done in the rabbits of old thrombus group 14 days after operation. Planar anterior abdominal images were obtained at 30, 60, 90 and 120 min after99Tcm-Annexin Ⅴ injection in all groups respectively. The ratios of thrombus to background of the two thrombus groups and the ratios of the area correspondent to the thrombus groups to background of the control group were calculated by ROIs counts. Then rabbits were executed, and thrombus was used for pathology examination.Results99Tcm-Annexin Ⅴ uptake in thrombi was clearly visualized in all rabbits of the fresh thrombus group; whilst negative images showed in all rabbits of the old thrombus group and control group. The thrombus to background ratios of the fresh thrombus group (4.06±0.49) were higher than that of the old thrombus group (2.46±0.38), and also higher than the inferior vena cava below inferior pole of right kidney level to background ratios (2.27±0.24) of the control group (t=5.746, 7.318; P＜0.05). All the thrombi of the fresh thrombus group were confirmed as fresh mixed thrombi by HE staining, and those of the old thrombus group were confirmed as old mixed organized thrombi.Conclusion99Tcm-Annexin Ⅴ may become a new acute venous thrombus imaging tracer used to discriminate fresh venous thrombus from old one.

Venous thromboembolism; Vena cava, inferior; Tomography, emissioncomputed, single-photon; Organotechnetium compounds; Annexins; Contrast media; Disease models, animal; Rabbits

河北省人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 河北石家莊050051

邊艷珠

Department of Nuclear Medicine, Hebei Genral Hospital, Shijiazhuang 050051, China

Address Correspondence to: BIAN Yanzhu

E-mail: hyx8144@126.com

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目（20110224）。

R-33；R445.5

2013-06-04

修回日期：2013-09-11

中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志

2013年 第21卷 第10期：725-728

Chinese Journal of Medical Imaging

2013 Volume 21(10): 725-728

10.3969/j.issn.1005-5185.2013.10.002