何莉　賈文慶

摘 要：以郁李花粉為試材，利用離體培養(yǎng)法、碘-碘化鉀染色法、醋酸洋紅染色法和TTC（氯化三苯基四氮唑）染色法對(duì)花粉生活力進(jìn)行測(cè)定，并研究了不同貯藏條件對(duì)花粉萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖和硼酸對(duì)花粉的萌發(fā)有促進(jìn)作用，郁李花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為：15%蔗糖+0.004%硼酸，萌發(fā)率達(dá)41.52%。花粉生活力隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，不同的貯藏條件對(duì)其有顯著的影響，適當(dāng)?shù)牡蜏乜捎行а娱L(zhǎng)花粉貯藏時(shí)間。其中-80 ℃萌發(fā)率最高，為最佳貯藏方法。

關(guān)鍵詞：郁李；花粉；生活力；貯藏

中圖分類號(hào)：S662.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.05.002

郁李（Prunus japonica Thunb）為薔薇科梅屬灌木，桃紅色寶石般的花蕾，繁密如云的花朵，深紅色的果實(shí)，美麗可愛，是園林中重要的觀花、觀果樹種 [1]。

花粉在有性繁殖中傳遞著雄性親本的遺傳信息。在農(nóng)業(yè)和林業(yè)的常規(guī)育種中，為了進(jìn)行人工輔助授粉或雜交授粉，需要早期采集和貯存花粉。尤其是在雜交育種工作中，研究花粉的生活力和育性是必不可少的基礎(chǔ)性工作[2]。保存花粉的活力是解決親本花期不一致或遠(yuǎn)距離雜交的主要途徑?；ǚ凵盍Φ蔫b定是采集和貯存花粉必須的檢測(cè)內(nèi)容。不同類群植物花粉在自然條件下的壽命、花粉的適宜貯存、營(yíng)養(yǎng)條件以及花粉生活力的適宜測(cè)定方法均有所差異[2]。掌握適宜的培養(yǎng)、貯存方法及生活力檢測(cè)的方法對(duì)于提高植物育種效率具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

國(guó)內(nèi)外對(duì)郁李的研究主要集中在栽培[1]、園林應(yīng)用[3]、病蟲害防治[1]等方面，對(duì)郁李花粉生活力及其貯藏特性研究尚未見報(bào)道。為此，筆者通過用染色法、培養(yǎng)基萌發(fā)法對(duì)郁李花粉生活力進(jìn)行了探討，并研究了不同貯藏條件及時(shí)間對(duì)其花粉生活力的影響，以期為郁李的引種、育種提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

郁李花粉采于河南科技學(xué)院院內(nèi)。于晴天上午10：00采集，選取含苞待放的花朵，帶回實(shí)驗(yàn)室后去除花瓣取花藥于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于（25±1） ℃的培養(yǎng)箱散粉12 h后，收集花粉備用。

1.2 最佳培養(yǎng)基篩選

采用2因素（蔗糖、硼酸）完全隨機(jī)試驗(yàn)，蔗糖為0，10%，15%，20%，25%；硼酸濃度為0，0.001%，

0.002%，0.003%，0.004%，0.005%。培養(yǎng)基均添加瓊脂8 g·L-1，pH值調(diào)至5.8。

將培養(yǎng)基倒入凹玻片的凹處，與蓋玻片表面平行，待冷卻后，用頭發(fā)絲蘸取花粉均勻散于培養(yǎng)基上，將凹玻片置于鋪有兩層濕濾紙的培養(yǎng)皿中，在（25±1） ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2，4，8，16 h后，觀察統(tǒng)計(jì)出萌發(fā)的花粉數(shù)和未萌發(fā)的花粉粒數(shù)。計(jì)算萌發(fā)率，每處理3次重復(fù)，每重復(fù)統(tǒng)計(jì)花粉數(shù)不少于100粒。

萌發(fā)率=萌發(fā)花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù)×100%

1.3 花粉染色法

1.3.1 I2-KI染色法 用頭發(fā)絲蘸取花粉置于載玻片上，加一滴I2-KI溶液，蓋上蓋玻片，靜置3～4 min后置于顯微鏡下觀察。染色后有生活力的花粉呈藍(lán)色，無(wú)生活力的花粉無(wú)色。觀察3張載玻片，每個(gè)載玻片取3個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)算有生活力的花粉所占百分率的平均值。

1.3.2 TTC（氯化三苯基四氮唑）染色法 用上述方法蘸取花粉置于載玻片上，加1滴0.5%TTC溶液，蓋上蓋玻片，置于30 ℃恒溫箱中，10～15 min后鏡檢。凡被染紅色的花粉活力強(qiáng)，淡紅色次之，無(wú)色者為沒有活力或不育花粉。觀察3張載玻片，每張載玻片取3個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)算有生活力花粉所占百分率的平均值。

1.3.3 醋酸洋紅染色法 蘸取花粉置于載玻片上，加一滴醋酸洋紅溶液，蓋上蓋玻片，立刻置于顯微鏡下觀察。凡被染成紅色的均為有生活力的花粉。

1.4 貯藏方法

花粉采集陰干后，裝入離心管放在以下4種環(huán)境條件下貯存：A.室溫；B. 4 ℃；C. -20 ℃；D.-80 ℃。貯藏5，10，15，20，25 d后，取出花粉置于1.2所得最佳培養(yǎng)基培養(yǎng)，16 h后觀察統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率。花粉耐貯藏力是以待測(cè)花粉活力保持時(shí)間即待測(cè)樣活力降為零的時(shí)間長(zhǎng)度來(lái)表示[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體培養(yǎng)法對(duì)郁李花粉萌發(fā)的影響

表1表明，花粉在單一蔗糖或硼酸的培養(yǎng)基上萌發(fā)率很低，其中20%蔗糖單獨(dú)使用時(shí)最好，花粉的萌發(fā)率為21.17%，硼酸單獨(dú)使用時(shí)以0.004%最好，萌發(fā)率為15.59%，但試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，20%蔗糖+0.004%硼酸培養(yǎng)基并不是花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基。在完全隨機(jī)試驗(yàn)中，蔗糖、硼酸、蔗糖×硼酸差異都極顯著。表1表明，蔗糖和硼酸最佳的培養(yǎng)基為：15%蔗糖+0.004%硼酸，花粉萌發(fā)率最高，發(fā)芽率達(dá)41.52%。

2.2 TTC染色法、I2-KI染色法和醋酸洋紅染色法

觀察發(fā)現(xiàn)，用碘-碘化鉀染色后，染成深藍(lán)色（即有生活力）的花粉有24.6%，黃褐色（即缺失生活力）的花粉為75.4%；而TTC染色后，所觀察的視野中郁李的花粉粒均未染色；醋酸洋紅染色后，呈深紅色（即有生活力）的花粉粒達(dá)89.2%，淺紅（無(wú)生活力）的花粉粒為11.8%。以上3種染色方法均與離體培養(yǎng)法最佳培養(yǎng)基得出的萌發(fā)率（41.52%）相比，差距很大。因此，醋酸洋紅染色法、碘-碘化鉀法、TTC法均不易作為測(cè)定郁李花粉生活力的染色劑。

2.3 不同貯藏環(huán)境條件對(duì)花粉生活力的影響

由表2可知，不同貯藏條件對(duì)花粉生活力有明顯的影響，花粉萌發(fā)率隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。花粉在常溫下保存生活力明顯下降，所以花粉不適宜在常溫條件下保存（圖1-1）。在低溫（4 ℃和-20 ℃）條件下，花粉生活力呈較小幅度平穩(wěn)下降，但整體上萌發(fā)率不高，到第25天花粉生活力僅為3.73%和6.35%（圖1-2，圖1-3）。在超低溫（-80 ℃）條件下，花粉生活力的變化趨勢(shì)非常緩和，花粉的萌發(fā)率明顯高于其他環(huán)境條件，貯藏25 d后萌發(fā)率還可達(dá)到17.49%（圖1-4）。綜合比較，郁李花粉貯藏的最佳方式為超低溫（-80 ℃）貯藏，可較長(zhǎng)時(shí)間保持花粉生活力，室溫環(huán)境不利于花粉的長(zhǎng)期貯藏。

3 結(jié)論與討論

3.1 花粉生活力鑒定的方法

目前，關(guān)于花粉生活力鑒定的方法很多，主要有顯微鏡形態(tài)觀測(cè)、染色法、培養(yǎng)基發(fā)芽法[5]，其中染色法又有TTC染色法、醋酸洋紅染色法、I2-KI染色法等。利用染色法進(jìn)行花粉生活力測(cè)定具有快速簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但受花粉自身特性（如花粉壁的厚薄，花粉外壁的組成物質(zhì)，花粉內(nèi)各種酶活性的強(qiáng)弱等）的影響較大，因此，不同的染色法只適合某些植物花粉生活力的測(cè)定。趙統(tǒng)利等[6]對(duì)百合花粉生活力測(cè)定也認(rèn)為，I2—KI法不能準(zhǔn)確表示花粉的活力。本試驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)也證明了這一點(diǎn)。而培養(yǎng)基發(fā)芽法應(yīng)用較為普遍，并且其測(cè)定結(jié)果比較精確可靠[7-9]，但不同植物花粉萌發(fā)的時(shí)間不同，適合萌發(fā)的條件也不同[7-10]。筆者采用培養(yǎng)基發(fā)芽法來(lái)測(cè)定郁李花粉的生活力。

3.2 最佳培養(yǎng)基篩選

有關(guān)研究認(rèn)為，在培養(yǎng)基里添加適宜濃度的蔗糖和硼酸有利于花粉的萌發(fā)，蔗糖一方面為花粉萌發(fā)和花粉管的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，另外還起著維持花粉與培養(yǎng)液之間滲透平衡、避免花粉及花粉管破裂的作用[11]。硼酸可以促進(jìn)糖的吸收和代謝，與糖結(jié)合能極大地提高花粉的萌發(fā)率，增加氧氣的含量和吸收，參與果膠物質(zhì)的合成[12]，利于花粉管的建造[13]。本試驗(yàn)分別采用不同濃度的蔗糖和不同濃度的硼酸進(jìn)行試驗(yàn)，得出最適合郁李花粉萌發(fā)的蔗糖濃度為20%，硼酸濃度為0.004%，萌發(fā)率分別為21.17%和15.59%。但通過完全隨機(jī)試驗(yàn)后，確定出最適合郁李花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基組合為15%蔗糖+0.004%硼酸，萌發(fā)率達(dá)41.52%。

3.3 最適貯藏方法篩選

花粉在不同的溫度下表現(xiàn)不同的耐貯藏力[14]?？偟膩?lái)說，低溫條件下花粉活力保持時(shí)間較室溫條件下花粉活力保持時(shí)間要長(zhǎng)，本試驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)。花粉在干燥、低溫、真空中貯藏可以有效延長(zhǎng)花粉活力的保持時(shí)間[15]，研究還證實(shí)超低溫條件下貯藏花粉，有效延長(zhǎng)花粉活力保持時(shí)間[16]。對(duì)于大多數(shù)植物的花粉來(lái)說，溫度、濕度、大氣成分[17]是貯藏條件的3個(gè)重要因素，其中溫度的影響尤為重要[17]。原因是低溫降低了花粉的呼吸強(qiáng)度，花粉的代謝速度減小從而延長(zhǎng)花粉活力保持時(shí)間。低溫對(duì)于延長(zhǎng)花粉活力的保持時(shí)間是有效的。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，郁李花粉貯藏的最佳方式為超低溫（-80 ℃）貯藏，貯藏25 d后萌發(fā)率達(dá)到17.49%，室溫環(huán)境不利于花粉的長(zhǎng)期貯藏。

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