孔年紅

21世紀(jì)是基因工程技術(shù)蓬勃發(fā)展的時(shí)代，基因工程的興起是生物革命的必然結(jié)果，盡管基因工程的隱憂及爭(zhēng)論眾說(shuō)紛紜，但其給人帶來(lái)的好處是顯而易見(jiàn)的。于是，作為熱點(diǎn)題，近幾年的高考題及一些模擬試卷中都有此類題型出現(xiàn)，且越考越細(xì)，難度也有所加大。下面筆者舉兩例談?wù)劥祟愵}目的解析。

（1）①和②過(guò)程中所用的限制性內(nèi)切酶分別是______、______。

（2）基因表達(dá)載體除了圖示組成外，至少還有______等（至少答兩個(gè)）。

（3）③過(guò)程中用酶切法可鑒定正、反義表達(dá)載體。用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切正義基因表達(dá)載體獲得0.05kb、3.25kb、5.95kb、9.45kb四種長(zhǎng)度的DNA片段，則用NotⅠ酶切反義基因表達(dá)載體獲得DNA片段的長(zhǎng)度應(yīng)是______和______。

（4）④過(guò)程中利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞的過(guò)程中，整合到棉花細(xì)胞染色體DNA的區(qū)段是______，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞再通過(guò)______形成植物體。

（5）導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的反義GhMnaA2 轉(zhuǎn)錄的mRNA能與細(xì)胞內(nèi)的GhMnaA2轉(zhuǎn)錄的mRNA互補(bǔ)配對(duì)，從而抑制基因的表達(dá)，其意義是______。

【解析】這道題考查了基因工程的步驟、意義以及涉及的其它生物技術(shù)，比較具體。基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心，因此是本題的重點(diǎn)考查內(nèi)容。構(gòu)建目的基因的表達(dá)載體必須使目的基因和載體被限制性核酸內(nèi)切酶同時(shí)酶切后露出相同的粘性末端。

（1）從圖中可以看出，纖維細(xì)胞E6啟動(dòng)子兩側(cè)分別是限制酶HindⅢ和BamHⅠ的識(shí)別位點(diǎn)，所以①過(guò)程所用的限制性內(nèi)切酶就是HindⅢ、BamHⅠ。同樣，目的基因GhMnaA2 兩側(cè)都是限制酶SmaⅠ的識(shí)別位點(diǎn)，所以②過(guò)程中所用的限制性內(nèi)切酶就是SmaⅠ。

（2）基因表達(dá)載體的組成有復(fù)制原點(diǎn)、目的基因、啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因。

（3）如下圖，把用SmaⅠ酶和NotⅠ酶切正義基因表達(dá)載體獲得DNA片段長(zhǎng)度標(biāo)在左圖上，同樣在右圖上也可以標(biāo)上相應(yīng)的DNA片段長(zhǎng)度，則用NotⅠ酶切反義基因表達(dá)載體獲得DNA片段的長(zhǎng)度應(yīng)是6.0kb和12.7kb。

（4）農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。所以④過(guò)程中利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化棉花細(xì)胞的過(guò)程中，整合到棉花細(xì)胞染色體DNA的區(qū)段是（含有E6啟動(dòng)子和GhMnaA2基因的）T-DNA。而轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞形成植物體就是植物組織培養(yǎng)。

（5）導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的反義GhMnaA2 轉(zhuǎn)錄的mRNA能與細(xì)胞內(nèi)的GhMnaA2 轉(zhuǎn)錄的mRNA互補(bǔ)配對(duì)，從而抑制基因的表達(dá)，就不能產(chǎn)生的β-甘露糖苷酶，就不能催化半纖維素降解，棉纖維長(zhǎng)度也就不會(huì)變短。

請(qǐng)據(jù)圖回答下列有關(guān)問(wèn)題：

（1）設(shè)計(jì)引物是cDNA（互補(bǔ)DNA）文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程的第一步，引物長(zhǎng)度一般在15-30個(gè)堿基之間，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。若引物過(guò)短則存在______等問(wèn)題。

（2）圖甲過(guò)程②、③分別需要在____、____酶的作用下形成cDNA 的第一條鏈、第二條鏈，這兩個(gè)過(guò)程都需要利用_____作為原料。

（3）在⑤和⑦過(guò)程中cDNA和質(zhì)粒DNA的3'端都要各加上一段寡聚核苷酸（20個(gè)以下堿基的核苷酸短鏈），制成_____；過(guò)程⑧在DNA連接酶的作用下，形成重組DNA。圖示這種情況下能形成_____種重組DNA，理由是______。

（4）請(qǐng)根據(jù)圖乙電泳圖譜分析各限制酶的酶切位點(diǎn)，并在答題紙的質(zhì)粒上標(biāo)出各個(gè)限制酶的酶切位點(diǎn)和各位點(diǎn)間的大小。

【解析】這道題考查了構(gòu)建基因文庫(kù)的過(guò)程及相關(guān)知識(shí)。

（1）設(shè)計(jì)引物是cDNA（互補(bǔ)DNA）文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程的第一步，引物長(zhǎng)度一般在15-30個(gè)堿基之間，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。若引物過(guò)短會(huì)降低退火溫度影響引物與堿基配對(duì)，從而使非特異性增高。

（2）以mRNA為模板合成cDNA需要逆轉(zhuǎn)錄酶，以單鏈cDNA為模板，由依賴DNA的DNA聚合酶作用合成雙鏈cDNA。合成cDNA需要的原料為4種游離的脫氧核苷酸。

（3）在⑤和⑦過(guò)程中cDNA和質(zhì)粒DNA的3'端都要各加上一段寡聚核苷酸（20個(gè)以下堿基的核苷酸短鏈），制成黏性末端。同一種DNA的兩端的黏性末端是相同的，不存在自身環(huán)化或同種DNA兩兩結(jié)合的現(xiàn)象，所以只有目的基因正反兩種連接方式。

（4）根據(jù)圖乙電泳圖譜分析各限制酶的酶切位點(diǎn)判斷EcoRI的酶切位點(diǎn)在PstI和SalI之間。再畫(huà)圖，注意堿基對(duì)的多少比例。

答案：（1）沒(méi)有一定的特異性，容易導(dǎo)致錯(cuò)配（或影響退火溫度）；（2）逆轉(zhuǎn)錄酶；DNA聚合酶；游離的脫氧核苷酸（3）黏性末端；1（或2）；同一種DNA的兩端的尾巴是相同的，不存在自身環(huán)化或同種DNA兩兩結(jié)合的現(xiàn)象。（4）如下圖（2分）。

此類題的解答主要是依據(jù)基因工程的操作步驟中每一步的知識(shí)點(diǎn)，抓住題目文字和圖示，必要時(shí)自己動(dòng)手畫(huà)畫(huà)，多見(jiàn)識(shí)多練習(xí)，功到自然成。

（作者單位：江蘇省黃橋中學(xué)）