何家亨等

摘要：通過(guò)低濃度營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基分離4種不同陳化煙葉表面的微生物，經(jīng)過(guò)連續(xù)2～4周的培養(yǎng)，共獲得55株不同的菌株，通過(guò)16S rDNA擴(kuò)增和測(cè)序進(jìn)行初步的分子鑒定后，進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，挑選每個(gè)菌株最大一致性的同源菌株16S rDNA序列一起進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果表明， 陳化煙葉中微生物存在著廣泛的多樣性，每種煙草中都擁有自己獨(dú)特的微生物菌群，存在大量的兼性寡營(yíng)養(yǎng)菌，專性寡營(yíng)養(yǎng)菌較少，而且煙葉的品種和等級(jí)直接影響到微生物的種群和數(shù)量。

關(guān)鍵詞：陳化煙葉；寡營(yíng)養(yǎng)菌；細(xì)菌多樣性；16 S rDNA序列；聚類分析

中圖分類號(hào)：TS41+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）06-1292-06

煙葉在制成成煙之前需要經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的陳化期，煙葉陳化是卷煙工業(yè)的一種初加工方法。當(dāng)年收獲的新煙葉，其品質(zhì)都存在不同程度的缺陷，不宜直接用于制造卷煙，必須進(jìn)行陳化處理[1]。在陳化發(fā)酵過(guò)程中，煙葉主要化學(xué)成分發(fā)生變化，青、雜氣和刺激性大大減輕，香氣顯露，氣味醇和，色澤均勻并加深[2]。煙葉表面的微生物發(fā)酵作用，對(duì)煙葉的陳化起著重要的作用。新煙葉在經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的陳化階段后，煙葉的品質(zhì)進(jìn)一步得到改善，有害物質(zhì)的含量也隨著降低。這個(gè)時(shí)期一般需要2～3年，如何縮短這個(gè)時(shí)期一直是科研工作者的研究熱點(diǎn)[1，3-5]。

煙葉表面含有豐富的微生物已有大量研究報(bào)道，如Zhao等[6]通過(guò)非純培養(yǎng)的方法對(duì)多種不同陳化時(shí)期的煙葉表面微生物進(jìn)行了研究，采用16S rDNA PCR-DGGE技術(shù)進(jìn)行多樣性分析發(fā)現(xiàn)，早期陳化階段各種煙葉擁有相似的優(yōu)勢(shì)微生物種群結(jié)構(gòu)，主要有5種細(xì)菌，其中3種為未培養(yǎng)微生物。Huang等[7]通過(guò)RLFP 技術(shù)構(gòu)建OTUs（Operational taxonomic units）克隆文庫(kù)比較陳化與非陳化煙葉細(xì)菌多樣性發(fā)現(xiàn)，在陳化的煙葉中存在大量的未培養(yǎng)微生物。韓錦峰等[8]通過(guò)對(duì)未發(fā)酵、自然陳化及人工發(fā)酵期間的烤煙葉面微生物進(jìn)行分離、鑒定，并對(duì)不同發(fā)酵時(shí)期微生物進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究，結(jié)果表明，未發(fā)酵烤煙葉面微生物數(shù)量最多，但是隨著自然陳化及人工發(fā)酵的進(jìn)行，葉面微生物數(shù)量均逐漸減少，且以芽孢桿菌屬（Bacillus）和梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium）為優(yōu)勢(shì)種群。朱大恒等[9]研究也發(fā)現(xiàn)烤煙中以芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌為優(yōu)勢(shì)種群。而且大量研究表明烤煙葉面微生物中，細(xì)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，放線菌和霉菌較少，細(xì)菌中以芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群，霉菌中以曲霉為優(yōu)勢(shì)菌群。優(yōu)良品種烤煙葉面微生物的數(shù)量較大，種類也較多。因此研究不同煙草表面的微生物多樣性具有重要意義。

寡營(yíng)養(yǎng)菌概念提出時(shí)沒(méi)有特指哪一類的微生物[10]。直到1979年，Kuznetsov等[11]才提出了寡營(yíng)養(yǎng)菌是特指那些第一次培養(yǎng)時(shí)可以在含碳濃度為1～15 mg/L培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌，并把它分為兩類，一類為在寡營(yíng)養(yǎng)和富營(yíng)養(yǎng)條件下均能生長(zhǎng)的細(xì)菌，稱為兼性寡營(yíng)養(yǎng)菌；另一類為只能在寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌，稱為專性寡營(yíng)養(yǎng)菌?？蒲泄ぷ髡攥F(xiàn)在已經(jīng)從多種生境中分離到了寡營(yíng)養(yǎng)菌，它廣泛存在于海洋、湖泊、河流、土壤甚至飲用水中。Arthur[12]指出了寡營(yíng)養(yǎng)菌營(yíng)養(yǎng)偏好的原因，Button等[13]則研究了它對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的動(dòng)力學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)寡營(yíng)養(yǎng)菌的米氏常數(shù)較低，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的親和力大于富營(yíng)養(yǎng)菌，因而在寡營(yíng)養(yǎng)條件下能夠獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。國(guó)內(nèi)關(guān)于寡營(yíng)養(yǎng)菌的研究起步晚，報(bào)道得也少。潘惠霞等[14]通過(guò)分離新疆沙漠中寡營(yíng)養(yǎng)菌并對(duì)其在防風(fēng)固沙方面進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，一些寡營(yíng)養(yǎng)菌產(chǎn)生的胞外多糖能夠?qū)ι沉．a(chǎn)生粘連作用。和振花等[15]對(duì)極地海水中寡營(yíng)養(yǎng)菌多樣性進(jìn)行了研究。

目前尚沒(méi)有研究煙葉中寡營(yíng)養(yǎng)菌的報(bào)道，根據(jù)以往關(guān)于陳化煙葉表面微生物分離和多樣性的報(bào)道推測(cè)，在漫長(zhǎng)的陳化過(guò)程中，尤其是對(duì)于煙草品質(zhì)提升有關(guān)鍵作用的中后期，可利用的簡(jiǎn)單營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)幾乎消耗殆盡，大部分菌株死亡，只有寡營(yíng)養(yǎng)菌株才有可能生長(zhǎng)。隨著陳化時(shí)間的延長(zhǎng)，煙草的等級(jí)就越高，品質(zhì)就越好，最后起作用的主要是寡營(yíng)養(yǎng)菌。因此，研究陳化煙葉中寡營(yíng)養(yǎng)菌的多樣性，對(duì)于解釋傳統(tǒng)的陳化作用如何利用微生物來(lái)改善煙葉品質(zhì)有著十分重要的意義。此次試驗(yàn)嘗試?yán)霉褷I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基對(duì)陳化煙葉表面的可培養(yǎng)寡營(yíng)養(yǎng)菌進(jìn)行分離和多樣性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙葉樣品 2010年的廣西百色烤煙K326 C3F等級(jí)，湖北恩施烤煙云85 C3F等級(jí)，湖北恩施烤煙云85 B3F等級(jí)，湖北宜昌馬里蘭煙馬里蘭1號(hào)中部一級(jí)。

1.1.2 培養(yǎng)基 DNG固體培養(yǎng)基：TSB 15 mg，去離子水100 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。DNG液體培養(yǎng)基：TSB 15 mg， Gellan agar 1.5 g，CaCl2溶液37.5 μmol/L，去離子水100 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉15 g/L。

1.2 方法

1.2.1 材料的預(yù)處理 取適量的煙葉在無(wú)菌條件下剪碎，用100 mL去離子水浸泡10 min，在搖床上200 r/min振蕩20 min。利用無(wú)菌紗布過(guò)濾，取濾液，然后離心去上清，用1 mL無(wú)菌水重懸。

1.2.2 陳化煙葉中菌株的分離與篩選 取100 μL濾液進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋液涂布DNG固體平板，并用封口膜或者一次性PE手套密封，于25 ℃培養(yǎng)2～4周，每隔3 d觀察1次，將獲得的單菌落進(jìn)行分區(qū)劃線進(jìn)一步分離與純化。將已獲得純培養(yǎng)的菌株接種于LB固體培養(yǎng)基中，觀察菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.3 陳化煙葉中分離菌株的16S rDNA分子鑒定 提取已獲得純培養(yǎng)菌株的總DNA[16]，采用16S rDNA通用引物[17]進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物為1492R： 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。按如下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，54 ℃、30 s，72 ℃、90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃、7 min。PCR產(chǎn)物采用凝膠純化試劑盒純化，純化步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。純化的PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST同源比對(duì)。

1.2.4 不同煙葉分離寡營(yíng)養(yǎng)菌的系統(tǒng)聚類分析 將每種煙葉所分離寡營(yíng)養(yǎng)菌的16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，挑選每個(gè)菌株最大一致性的同源菌株的16S rDNA序列一起利用軟件Clustal W 2.0和MEGA 5.1進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 專性寡營(yíng)養(yǎng)菌的鑒別 將篩選出的菌株再次在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不能生長(zhǎng)的為專性寡營(yíng)養(yǎng)菌；能生長(zhǎng)的菌株，為了排除污染的可能性，將可以生長(zhǎng)的菌株進(jìn)一步用寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，能在寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基生長(zhǎng)的為兼性寡營(yíng)養(yǎng)菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣西百色烤煙K326 C3F等級(jí)可培養(yǎng)寡營(yíng)養(yǎng)菌的分離與16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)利用寡營(yíng)養(yǎng)和長(zhǎng)期培養(yǎng)的方法，從該煙葉中共分離出12株菌株，具體見(jiàn)表1。利用Clustal W 2.0和MEGA 5.1進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖1所示。從圖1可以看出，在C3F等級(jí)陳化煙葉中一共存在10個(gè)菌屬，它們分別為泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、微桿菌屬（Microbacterium）、古氏庫(kù)特菌屬（Kurthia gibsonii）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、副球菌屬（Paracoccus）、法氏沃氏菌屬（Wautersiella falsenii）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、微球菌屬（Micrococcus）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）。通過(guò)1.2.5的方法發(fā)現(xiàn)菌株C3F18只能在寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基生長(zhǎng)，由此可以看出在此種陳化煙葉中只有C3F18為可培養(yǎng)的專性寡營(yíng)養(yǎng)菌，其他菌株均為兼性寡營(yíng)養(yǎng)菌株。

2.2 湖北恩施烤煙云85 C3F等級(jí)可培養(yǎng)寡營(yíng)養(yǎng)菌的分離與16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)利用寡營(yíng)養(yǎng)和長(zhǎng)期培養(yǎng)的方法，從該煙葉中共分離出10株菌株，具體見(jiàn)表2。利用Clustal W 2.0和MEGA 5.1進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖2所示。從圖2可以看出，在恩施云85 C3F等級(jí)陳化煙葉中一共存在7個(gè)菌屬，分別為假單胞菌屬、古氏庫(kù)特菌屬、微小桿菌屬、微球菌屬、類芽孢桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬和芽孢桿菌屬。C3FN7和C3FN18只能在寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，由此可以看出在此種陳化煙葉中只有C3FN7和C3FN18為可培養(yǎng)的專性寡營(yíng)養(yǎng)菌，其他的菌株均為兼性寡營(yíng)養(yǎng)菌株。

2.3 湖北恩施烤煙云85 B3F等級(jí)可培養(yǎng)寡營(yíng)養(yǎng)菌的分離與16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)利用寡營(yíng)養(yǎng)和長(zhǎng)期培養(yǎng)的方法，從該煙葉中共分離出15株菌株，具體見(jiàn)表3。利用Clustal W 2.0和MEGA 5.1進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖3所示。從圖3可以看出，該種陳化煙葉中一共存在10個(gè)屬，分別為副球菌屬、微球菌屬、假單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、腸桿菌屬（Enterobacter）、節(jié)桿菌屬（Brevibacterium）、歐文氏菌屬（Erwinia）、蓋球菌屬（Kytococcus）、短小芽孢桿菌屬（Bacillus pumilus）以及泛菌屬。分離的菌株都能在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，可見(jiàn)從此種煙草中分離的均為兼性寡營(yíng)養(yǎng)菌。

2.4 湖北宜昌馬里蘭煙馬里蘭1號(hào)中部一級(jí)可培養(yǎng)寡營(yíng)養(yǎng)菌的分離與16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)利用寡營(yíng)養(yǎng)和長(zhǎng)期培養(yǎng)的方法，從該煙葉中共分離出18株菌株，具體見(jiàn)表4。利用Clustal W 2.0和MEGA 5.1進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)如圖4所示。從圖4進(jìn)化樹(shù)中可以看出，該種陳化煙葉中一共存在10個(gè)屬，它們分別為假單胞菌屬、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、法氏沃氏菌屬、副球菌屬、微球菌屬、蓋球菌屬、考克氏菌屬（Kocuria）、鞘脂桿菌屬（Sphingobacterium）、類香菌屬（Myroides）。菌株M10和M32只能在寡營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，由此可以看出在此種陳化煙葉中有2種可培養(yǎng)的專性寡營(yíng)養(yǎng)菌。

3 討論

由于寡營(yíng)養(yǎng)菌獨(dú)特的生態(tài)功能，對(duì)于減少煙葉中有害物質(zhì)，提高煙葉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，增加煙農(nóng)收入，改善煙草存儲(chǔ)條件，改善吸煙者的健康狀況都有重要的意義。通過(guò)分離這4種煙葉的寡營(yíng)養(yǎng)菌，結(jié)合煙葉本身的特色，發(fā)現(xiàn)微生物的多樣性和煙葉的品種和質(zhì)量有一定的內(nèi)在聯(lián)系，例如湖北恩施烤煙云85中的B3F和C3F兩個(gè)等級(jí)煙葉中的Kytococcus schroeteri和Bacillus pumilus以及Enterobacteriaceae bacterium為湖北恩施烤煙云85中獨(dú)特的微生物，又因?yàn)锽3F的物質(zhì)含量多些，對(duì)應(yīng)的微生物種類也相應(yīng)多些。而4種煙葉中由于馬里蘭煙葉與其他烤煙煙葉有著明顯不同，微生物種類一是數(shù)量上多于其他三類，種類上也和其他三類差異很大，這一是因?yàn)轳R里蘭煙葉本身的香氣物質(zhì)不一樣，物質(zhì)種類有差異，物質(zhì)分解后產(chǎn)物也有差異，二是馬里蘭煙葉在涼棚中晾制，產(chǎn)生微生物也會(huì)更多。

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