孫海偉 曹德航 尚濤等

作者簡(jiǎn)介：孫海偉（1973-），男，博士，副研究員，主要從事茶樹、果樹遺傳育種研究。

摘要：茶樹[Camellia sinensis（L）OKuntze]是原產(chǎn)我國(guó)的葉用木本植物，山東自“南茶北引”取得成功以來(lái)，冬季低溫脅迫導(dǎo)致的凍害常造成經(jīng)濟(jì)損失。所以，抗寒育種研究一直是茶樹研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。本文闡述了茶樹抗寒育種的研究進(jìn)展，包括抗寒性研究、選育的抗寒品種、抗寒基因的分離和鑒定及轉(zhuǎn)基因研究現(xiàn)狀。

關(guān)鍵詞：茶樹；抗寒育種；抗寒基因；轉(zhuǎn)基因

中圖分類號(hào)：S571.103.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2013）06-0119-05

茶樹[Camellia sinensis（L）OKuntze]屬山茶科，山茶屬，原產(chǎn)于我國(guó)西南地區(qū)，是一種喜溫暖氣候條件的葉用植物。隨著人們對(duì)茶葉保健功能的認(rèn)識(shí)，茶葉需求量逐年增加，茶樹栽培面積不斷擴(kuò)大，種植區(qū)域不斷向北方拓展。山東省是我國(guó)的次適宜高緯度茶區(qū)，由于冬季氣溫低、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，茶樹極易受到凍害影響，給茶葉生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重的損失。自20世紀(jì)50年代末嘗試引種茶樹以來(lái)，山東茶樹引種栽培面積已經(jīng)達(dá)到167×104 hm2[1]，幾乎每年都要遭受不同程度的低溫凍害，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，抗寒育種成為茶樹育種研究的熱點(diǎn)。

1 茶樹抗寒性的研究

茶樹的抗寒性是在茶樹長(zhǎng)期適應(yīng)低溫脅迫的過(guò)程中通過(guò)自然選擇而逐步發(fā)展和形成的一種形態(tài)和生理特征。茶樹等溫帶地區(qū)的常綠闊葉樹種在抗寒機(jī)理上與草本植物和落葉木本植物有所不同：與草本植物相比，其冷馴化能力大得多，冷馴化機(jī)制更為復(fù)雜；與落葉木本植物相比，盡管具有季節(jié)性生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的特性，但其越冬葉卻沒有落葉木本植物葉那種遇冷引發(fā)的衰老、脫落過(guò)程，也不存在類似芽的內(nèi)生性休眠過(guò)渡。研究者們先后從葉片的形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)變化、束縛水含量、細(xì)胞液濃度、保護(hù)酶類（如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶等酶類）、低溫膜損傷、茶樹冰核活性細(xì)菌等多方面探索了茶樹的抗寒機(jī)理[2～11]，也找到了相應(yīng)的技術(shù)措施來(lái)提高茶樹抗寒能力，但是幾乎所有措施都需要投入大量的人力、物力、財(cái)力[1]。選育抗凍能力突出的良種，改良茶樹自身的遺傳因素來(lái)提高抗寒性能以抵御低溫脅迫是解決這一問(wèn)題最根本的方法[12]。

何孝延[2]對(duì)30份烏龍茶品種資源進(jìn)行抗寒性鑒定，結(jié)果表明，從整體而言，福建烏龍茶品種間的抗寒性無(wú)明顯差異，均表現(xiàn)為較抗寒類型。梅麗等[3]以從山東省茶葉主要產(chǎn)區(qū)（泰安市、青島市、日照市）采集的共計(jì)51個(gè)茶樹類型和品種的葉片為材料，對(duì)其內(nèi)部結(jié)構(gòu)與抗寒性的關(guān)系、內(nèi)部結(jié)構(gòu)與生產(chǎn)力指數(shù)的關(guān)系和束縛水含量進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)山東引種茶樹由于樣品間的差異以及所處地區(qū)的不同，抗寒能力與生產(chǎn)力指數(shù)均表現(xiàn)出明顯的差異；在所用的樣品中，抗寒能力勁峰最強(qiáng)，生產(chǎn)力指數(shù)福鼎大白毫最高，束縛水含量類型3最高、云南小葉最低；相關(guān)性分析表明，對(duì)山東引種茶樹進(jìn)行抗寒性評(píng)價(jià)時(shí)除了依據(jù)柵欄組織/海綿組織之外，柵欄組織細(xì)胞數(shù)目也是一個(gè)重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)；束縛水的含量與基于葉片解剖結(jié)構(gòu)計(jì)算的抗寒性指標(biāo)之間未見明顯的相關(guān)性，而束縛水含量/自由水含量與基于葉片解剖結(jié)構(gòu)計(jì)算的抗寒性指標(biāo)之間可見一定程度的正相關(guān)；進(jìn)行生產(chǎn)力評(píng)價(jià)時(shí)除了依據(jù)柵欄組織厚度與柵欄組織細(xì)胞數(shù)目之外，葉肉組織厚度與葉全厚度也是比較可靠的評(píng)價(jià)指標(biāo)，基于葉片解剖結(jié)構(gòu)計(jì)算的抗寒性指標(biāo)與生產(chǎn)力指數(shù)之間呈不顯著的正相關(guān)。孫銳等[4]選取山東引種茶樹的抗寒性較強(qiáng)的勁峰和抗寒性較弱的黃早作為材料，在冰凍脅迫條件下觀察細(xì)胞、組織水平的結(jié)構(gòu)變化，評(píng)價(jià)凍害的影響和受凍的原因，并且探討了細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器對(duì)凍害表現(xiàn)出的不同穩(wěn)定性。孫仲序等[5]經(jīng)對(duì)山東10地市茶區(qū)、6個(gè)氣象因子作最短距離聚類分析得出，山東茶主要分布在4個(gè)生態(tài)類型區(qū)域內(nèi)，茶樹凍害由輕到重呈花斑式分布；各氣象因子與葉片組織結(jié)構(gòu)變化呈正相關(guān)性，以年降水量和極端最低溫度對(duì)茶樹變異影響最大，其次是年平均溫度、無(wú)霜期和日照時(shí)數(shù)，1月份年均氣溫對(duì)葉片結(jié)構(gòu)變化影響不大；葉片結(jié)構(gòu)以柵欄組織厚度對(duì)氣候條件最敏感，其次是柵欄組織與海綿組織的比值、海綿組織厚度，葉片厚度和上表皮厚度與氣象因子無(wú)關(guān)。楊亞軍等[7]研究了冷馴化和ABA對(duì)茶樹抗寒力及其體內(nèi)脯氨酸含量的影響，結(jié)果表明，通過(guò)冷馴化或者ABA處理，茶樹經(jīng)歷了馴化再到脫馴化的過(guò)程，其抗寒力也相應(yīng)地發(fā)生了很大的變化，由馴化前的幾乎為零逐漸提高，而隨著脫馴化的進(jìn)行又迅速恢復(fù)到馴化前的水平；低溫馴化的臨界溫度為7℃左右，脫馴化的臨界溫度為9℃左右；人工低溫馴化和ABA處理，茶樹抗寒力的提高幅度沒有自然冷馴化下的大；冷馴化中茶樹體內(nèi)脯氨酸含量變化是對(duì)外界條件變化的一種綜合反應(yīng)，很難說(shuō)明單一的脯氨酸含量與抗寒力之間的因果關(guān)系。楊華等[13]采用以生物膜學(xué)說(shuō)為依據(jù)的電導(dǎo)法，經(jīng)過(guò)不同低溫脅迫處理對(duì)川茶群體種、平陽(yáng)特早、烏牛早、云南大葉種等4個(gè)茶樹品種的新梢（一芽三葉）和成熟葉片組織進(jìn)行了抗寒性測(cè)定，并結(jié)合Logistic方程分別計(jì)算了各茶樹品種的低溫半致死溫度（LT50），列出了供試品種抗寒性的相對(duì)強(qiáng)弱順序?yàn)椋浩疥?yáng)特早>烏牛早>川茶群體種>云南大葉種。

2 茶樹抗寒育種研究

多年來(lái)，茶樹育種研究工作者不斷選育出抗寒性茶樹品種（系）。如前蘇聯(lián)研究人員用中國(guó)種和印度種的雜交種混合花粉進(jìn)行輔助授粉，培育的格魯吉亞系7、8、12號(hào)，可以在-20℃的嚴(yán)寒地區(qū)栽培過(guò)冬。日本用茶和茶梅進(jìn)行種間雜交所獲得的茶梅系，其抗凍性大大提高[1]。近年來(lái)我國(guó)也相繼獲得了一些抗寒性強(qiáng)的優(yōu)良品種，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)系選育出特早生特抗寒茶樹新品種“農(nóng)抗早”和早生抗寒優(yōu)質(zhì)茶樹新品系“茶農(nóng)1號(hào)”[14，15]。浙江大學(xué)茶葉研究所選育出早生優(yōu)質(zhì)抗寒茶樹新品種“浙農(nóng)117” [16]。泰安市泰山林業(yè)科學(xué)研究院選育出“羅漢1號(hào)”[17]。由于茶樹為多年生木本植物，選育一個(gè)良種周期較長(zhǎng)，且大部分品種的抗寒能力并沒有得到顯著改善，在生產(chǎn)中仍然會(huì)發(fā)生凍害。因此，利用輻射誘變、轉(zhuǎn)基因等各種育種方法將抗性基因轉(zhuǎn)移入農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品種（系）中去，培育出優(yōu)質(zhì)高抗的新品種（系），會(huì)大大縮短常規(guī)育種的周期，獲得事半功倍的效果[6]。進(jìn)行茶樹抗性的轉(zhuǎn)基因育種，是茶樹抗性突破性育種的一個(gè)重要手段。下一步，應(yīng)加大對(duì)茶樹重要相關(guān)功能基因的研究投入，摸清主要性狀的遺傳規(guī)律和相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制，為茶樹的定向育種和分子育種奠定理論基礎(chǔ)。3 茶樹抗寒基因的分離和鑒定

近幾年，隨著擬南芥等模式植物抗寒機(jī)理系統(tǒng)研究的深入，茶樹抗寒分子機(jī)制研究出現(xiàn)熱潮。陳喧等[18]發(fā)現(xiàn)茶樹CBF基因只有低溫誘導(dǎo)后才會(huì)表達(dá)，低溫誘導(dǎo)4 h開始表達(dá)，在8 h左右表達(dá)量最高，然后開始下降，但仍維持在一個(gè)較高的水平。在植物抗寒途徑中，COR作為一種重要的冷應(yīng)答蛋白，被CBF激活后，激活一系列下游基因表達(dá)，抵抗低溫。梅菊芬等[19]采用mRNA差別顯示的方法對(duì)茶樹冷馴化過(guò)程中基因差異表達(dá)進(jìn)行了初步研究，從58條差異片段中得到穩(wěn)定擴(kuò)增的差異片段23條，用RT-PCR方法鑒定其假陽(yáng)性，得到5個(gè)陽(yáng)性片段，其中3個(gè)片段在冷馴化過(guò)程中表達(dá)量增加，另外2個(gè)片段的表達(dá)量降低。陳林波等[20]以中小葉茶樹良種舒茶早和云南大葉種73-11為材料，于4℃低溫處理4 d后，采用AFLP技術(shù)篩選出冷誘導(dǎo)下茶樹差異表達(dá)基因并進(jìn)行分析，結(jié)果獲得41個(gè)差異片段（TDFs），按功能可劃分為4類，即信號(hào)傳導(dǎo)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、基礎(chǔ)代謝相關(guān)蛋白、抗逆蛋白質(zhì)，此外還有一些假設(shè)蛋白質(zhì)及未知蛋白；利用qRT-PCR方法對(duì)Kh1、Kh3和Kh11差異片段進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示這3個(gè)片段均被低溫誘導(dǎo)，表達(dá)量上升。房婉萍等[21]利用cDNA-AFLP的方法分離克隆了茶樹中的H1-histone基因，BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，該片段與其它物種逆境誘導(dǎo)特異表達(dá)的H1-histone基因有很高的相似性，與煙草H1-histone基因編碼的氨基酸序列一致性達(dá)79%。冷脅迫條件下，茶樹的H1-histone在代謝中轉(zhuǎn)化為H1-S，H1-S的聚集會(huì)改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，對(duì)逆境信號(hào)進(jìn)行響應(yīng)，調(diào)控下游的一系列蛋白或響應(yīng)因子做不同形式的表達(dá)，與冷脅迫直接相關(guān)的基因CBF、COR、ICE的啟動(dòng)與調(diào)控都可能與H1-histone基因的調(diào)控相關(guān)。張莉等[22]利用cDNA-AFLP分析在-70℃貯藏1年后的茶籽基因表達(dá)，篩選到10個(gè)低溫差異表達(dá)片段，其中有7個(gè)與MYB類轉(zhuǎn)錄因子等有較高同源性。李先文等[23]運(yùn)用RACE技術(shù)從茶葉中克隆出一個(gè)冷誘導(dǎo)基因CsCOR1的全長(zhǎng)cDNA序列，并通過(guò)Real-time RT PCR方法分析了該基因在低溫、高滲和外源ABA處理時(shí)的表達(dá)狀況，結(jié)果顯示CsCOR1基因的表達(dá)可被低溫和脫水脅迫劇烈上調(diào)，可被外源ABA中度上調(diào)。鄒中偉等[24]利用cDNA-AFLP技術(shù)獲得了茶樹低溫表達(dá)的86個(gè)差異片段，在選擇回收的10條差異表達(dá)cDNA片段中，有4個(gè)片段與低溫脅迫有關(guān)。4 茶樹轉(zhuǎn)基因的研究

自20世紀(jì)90年代開展茶樹再生體系及基因遺傳轉(zhuǎn)化研究以來(lái)，一直未有很大的進(jìn)展，大量的工作都停留在轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化的階段。在研究人員的積極探索下，雖然有少量通過(guò)轉(zhuǎn)化體胚得到轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)道，但茶樹體胚的誘導(dǎo)體系仍未建立[25～31]。目前只有Bt基因、蛋白溶解酶基因嘗試向茶樹中轉(zhuǎn)化，但由于茶樹離體再生困難，受過(guò)創(chuàng)傷的茶樹受體轉(zhuǎn)化后的再生效率低，最終轉(zhuǎn)基因成功的報(bào)道僅1例[32]，而且還是通過(guò)嫁接轉(zhuǎn)基因嫩梢獲得的轉(zhuǎn)基因植株。

茶樹轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的主要問(wèn)題有：一是轉(zhuǎn)化效率低。茶樹中富含多酚類物質(zhì)，多酚類物質(zhì)一方面作為一種抑菌劑，直接殺死農(nóng)桿菌而影響轉(zhuǎn)化率；另一方面作為蛋白質(zhì)的沉淀劑，阻塞發(fā)根農(nóng)桿菌的T-DNA向茶樹細(xì)胞運(yùn)轉(zhuǎn)的通道，從而間接影響茶樹的遺傳轉(zhuǎn)化。迄今國(guó)內(nèi)外農(nóng)桿菌介導(dǎo)茶樹進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化成功率低的主要原因是缺乏穩(wěn)定完善的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的茶樹遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)體系。二是茶樹離體再生困難。高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系依賴于高頻的再生體系。茶樹的離體再生難度大，特別是器官發(fā)生途徑的植株再生。除子葉容易產(chǎn)生體細(xì)胞胚外，茶樹的各種器官都不容易再生，茶樹的莖段有再生成功的報(bào)道，但芽再生頻率很低，尚不明確哪種組織的再生能力強(qiáng)[33～36]。這些可能是導(dǎo)致部分遺傳轉(zhuǎn)化失敗的主要原因?，F(xiàn)代植物育種技術(shù)發(fā)展迅速，轉(zhuǎn)基因等新的育種手段已經(jīng)在其他植物上取得成功。今后，茶樹育種應(yīng)借鑒其它植物成功的經(jīng)驗(yàn)，加強(qiáng)技術(shù)攻關(guān)，在茶樹穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立、轉(zhuǎn)基因育種等方面做好技術(shù)儲(chǔ)備。

5 展望

來(lái)自熱帶和亞熱帶的許多作物缺乏冷馴化的能力，無(wú)法在溫帶以北的地區(qū)露地安全越冬，只有完成低溫馴化才可能忍耐較低的溫度而不受傷害。在馴化過(guò)程中涉及大量的基因表達(dá)重組和代謝變化，經(jīng)典遺傳學(xué)研究表明植物冷馴化能力是由微效多基因共同控制的數(shù)量性狀[37]。傳統(tǒng)的育種方法在改善植物耐凍性方面取得的成效非常有限，對(duì)提高植物抗寒性的作用不大[38]，例如到目前為止小麥品種和油菜品種抗寒性，只比幾百年前的品種稍微有點(diǎn)改善[39，40]。

茶樹起源于亞熱帶，多年生木本植物，由于生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，采用常規(guī)抗寒育種技術(shù)進(jìn)行新品種選育所需時(shí)間長(zhǎng)、見效慢，同時(shí)還存在基因源缺乏、雜合程度高和雜交不親和等制約因素。所以，通過(guò)確定茶樹抗凍基因的性質(zhì)，了解其感受低溫和調(diào)控抗凍性表達(dá)機(jī)制，利用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)改進(jìn)其遺傳組成，進(jìn)行抗凍性分子改良，具有高效性和針對(duì)性，可彌補(bǔ)常規(guī)育種技術(shù)的不足，加速高抗凍性茶樹新品種的選育進(jìn)程。

當(dāng)前我國(guó)茶樹抗寒性和抗寒育種研究雖然取得了一定的進(jìn)展，但在抗寒分子機(jī)制、轉(zhuǎn)基因研究等方面還缺乏深入研究，下一步還需要遺傳學(xué)、育種學(xué)、生理學(xué)、植物保護(hù)學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科長(zhǎng)期不懈的協(xié)作，開創(chuàng)茶樹抗寒分子育種研究的新局面。

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