韓同凱 王盈盈 林紅珍等

作者簡(jiǎn)介：韓同凱（1987-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種。

通訊作者：陳翠霞（1964-），女，教授，研究方向?yàn)樽魑镞z傳育種。

謝先芝（1972-），女，副研究員，研究方向?yàn)橹参锇l(fā)育生物學(xué)。

摘要：根據(jù)水稻ERECTA的cDNA序列（GenBank中的登陸號(hào)：Os06g0203800），利用NCBI的Blast工具找到OsERECTA所對(duì)應(yīng)的基因組DNA序列（gERECTA），根據(jù)該序列設(shè)計(jì)2對(duì)特異引物，對(duì)gERECTA進(jìn)行分段PCR擴(kuò)增，并對(duì)前后兩部分片段進(jìn)行克隆、測(cè)序和拼接。本研究得到的gERECTA序列為8 901 bp，其中包括約17 kb的 5′區(qū)域和約300 bp 的3′區(qū)域。將拼接起來(lái)的gERECTA序列插入到pCAMBIA1390載體，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，證明重組表達(dá)質(zhì)粒中帶有g(shù)ERECTA基因片段，表明gERECTA植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-gERECTA已成功構(gòu)建。

關(guān)鍵詞：水稻；OsERECTA基因；克??；植物表達(dá)載體

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2013）06-0004-07

水稻ERECTA基因是植物中編碼富含亮氨酸重復(fù)序列的類受體蛋白激酶基因家族（Leucine-rich repeat receptor-like kinase gene family）中的一員。Torii等（1996）[1]首次克隆得到擬南芥ERECTA基因。擬南芥ERECTA基因在頂端分生組織、植株幼嫩的或正在生長(zhǎng)的地上部分包括生長(zhǎng)發(fā)育中的葉片和花器官中表達(dá)，在成熟器官和根中不表達(dá)，且在植株發(fā)育早期的頂端分生組織中表達(dá)較弱，但在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)過(guò)渡階段表達(dá)水平提高[2]。

隨著對(duì)模式植物擬南芥ERECTA基因研究的深入，發(fā)現(xiàn)ERECTA基因通過(guò)協(xié)調(diào)細(xì)胞分裂和細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)包括花在內(nèi)的氣生器官結(jié)構(gòu)（如節(jié)間和花梗的伸長(zhǎng)和近軸-遠(yuǎn)軸極性）和氣孔模式（如氣孔密度和分布）[3～6]。已有報(bào)道證明擬南芥ERECTA基因調(diào)控某些生理過(guò)程如二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）的羧化率、電子傳遞能力、植株的蒸騰作用和水分利用效率等[6]。且ERECTA基因在植株對(duì)生物和非生物環(huán)境如熱脅迫、干旱和細(xì)菌感染的響應(yīng)中起作用[6～8]。

尹偉倫課題組克隆得到Populus nigra×（Populus deltoids×Populus nigra）ERECTA（PdERECTA）基因并培育了轉(zhuǎn)基因擬南芥植株（35S∶ PdERECTA）。PdERECTA過(guò)表達(dá)導(dǎo)致苗期初生根變長(zhǎng)、葉面積變大尤其是長(zhǎng)期水分利用率（Long-term water use efficiency）大大增強(qiáng)，這揭示出ERECTA基因具有提高作物水分利用率的潛在作用[9]。朱錦程等利用RT-PCR技術(shù)從擬南芥中克隆得到ERECTA基因并構(gòu)建真核表達(dá)載體pBin438-ERECTA，轉(zhuǎn)化番茄，結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)基因番茄植株的水分利用率得到提高[10]。

大多數(shù)高等真核生物基因都含有內(nèi)含子，其轉(zhuǎn)錄后的序列在剪接過(guò)程中從mRNA前體上切除。但很多情況下，內(nèi)含子對(duì)基因的功能是非常重要的，可能同選擇性剪接有關(guān)或者內(nèi)含子本身包含了重要的非編碼RNAs和ORFs。內(nèi)含子具有增強(qiáng)基因表達(dá)的作用，例如，在過(guò)渡相實(shí)驗(yàn)（Transient assay）中，包含內(nèi)含子的玉米乙醇脫氫酶1（Alcohol dehydrogenase-1）的表達(dá)量提高了50～100倍[11]。Karve等發(fā)現(xiàn)擬南芥ERECTA的表達(dá)強(qiáng)烈依賴內(nèi)含子的存在，內(nèi)含子是ERECTA基因mRNA積累所必需的[12]。因此，我們推測(cè)OsERECTA基因的表達(dá)同樣需要內(nèi)含子存在，本研究構(gòu)建了包含內(nèi)含子的ERECTA基因組DNA的植物表達(dá)載體。

1 材料與方法

11 試驗(yàn)材料

111 植物材料 水稻品種日本晴（Oryza sativa L cv Nipponbare）。樣品為溫室中生長(zhǎng)2周的幼苗葉片，液氮速凍后置于-70℃保存，用于全基因組DNA提取。

112 試驗(yàn)試劑 限制性內(nèi)切酶、DNA Ligase、DNA片段分子量標(biāo)記（λ-EcoT 14 I digest）、BAP均購(gòu)于TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于Bioteke公司；KOD-Plus-Neo DNA聚合酶購(gòu)于ToYoBo公司；DNA膠回收試劑盒、卡那霉素（Kan）、氨芐青霉素（Amp）購(gòu)于上海生工生物工程有限公司。

113 載體及菌株 克隆載體pMD18-T Vector、pTA2-T vector購(gòu)于TaKaRa公司；表達(dá)載體pCAMBIA1390（CAMBIA， Canberra， Australia）由本實(shí)驗(yàn)室保存；E coli DH 5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。pMD18-T Vector、pTA2-T vector具有Amp抗性；pCAMBIA1390具有Kan抗性。

114 引物設(shè)計(jì) 利用Primer Premier 50軟件，選擇得分較高、GC含量適中、無(wú)引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物對(duì)用于擴(kuò)增水稻gERECTA基因序列；引物合成和基因測(cè)序由Invitrogen公司完成。

12 實(shí)驗(yàn)方法

121 PCR擴(kuò)增 以全基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用KOD-Plus-Neo高保真酶（ToYoBo， Code： KOD-401），按照下列組成配成反應(yīng)液（50 μl體系），反應(yīng)液在冰上配制。PCR反應(yīng)體系為：10× PCR Buffer for KOD- Plus- Neo 5 μl、2 mmol/L dNTPs 5 μl、25 mmol/L MgSO4 3 μl、20 μmol/L引物 （each） 075 μl、模板（Genomic DNA） 200 ng、KOD -Plus-Neo （1 U/μl） 1 μl，加ddH2O至總體積為50 μl。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，（引物Tm值）退火30 s，68℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)。用10%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，并用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。

122 重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 利用TaKaRa公司的pMD18-T Vector和pTA2-T Vector試劑盒將PCR產(chǎn)物與T載體連接，進(jìn)行目的片段的克隆與鑒定。連接反應(yīng)液包含1 μl pMD18-T Vector（或者pTA2-T Vector）、4 μl Insert DNA和5 μl Solution I。反應(yīng)液混勻后于16℃連接反應(yīng)45 min。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp（100 mg/L）的LB平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)抗性篩選后挑取單菌落。搖菌提取質(zhì)粒后進(jìn)行酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

123 植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-gERECTA的構(gòu)建與鑒定 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建表達(dá)載體的流程圖見(jiàn)圖1。

（1）載體pCAMBIA1390-DgERECTA的構(gòu)建與鑒定：Hind Ⅲ和Spe Ⅰ雙酶切陽(yáng)性pMD18-DgERECTA，10%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段。利用DNA連接酶將目的片段定向連接到經(jīng)同樣處理的植物表達(dá)載體pCAMBIA1390中，轉(zhuǎn)化E coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Kan（50 mg/L）的LB平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落。搖菌提取質(zhì)粒后進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

（2）UgERECTA連接到pCAMBIA1390-DgERECTA載體：Hind Ⅲ酶切陽(yáng)性pTA2-UgERECTA，10%瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段。利用T4連接酶將目的片段連接到經(jīng)同樣酶切處理并經(jīng)BAP（E coli C75）酶去磷酸化后的陽(yáng)性pCAMBIA1390-DgERECTA載體中。轉(zhuǎn)化E coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Kan（50 mg/L）的LB平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單菌落。搖菌提取質(zhì)粒后進(jìn)行兩次質(zhì)粒單酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的即為含有完整gERECTA片段的植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-gERECTA。

2 結(jié)果與分析

21 特異性引物的設(shè)計(jì)

GenBank中的水稻OsERECTA基因cDNA序列所對(duì)應(yīng)的基因組DNA序列（GenBank登陸號(hào)：AP0049913）全長(zhǎng)為7 605 bp。利用Primer Premier 50軟件分別設(shè)計(jì)兩對(duì)特異引物，將gERECTA分為上游和下游兩部分（UgERECTA和DgERECTA）。為了便于后續(xù)與表達(dá)載體的連接，在部分引物中設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。擴(kuò)增UgERECTA序列的上游引物P1： 5′-CCCAAGCTTCAATAAACAAAGGCTAATCTTG-3′，下游引物P2： 5′-GAATTAAAATATCTTGAAAGCTTCAT-3′，下劃線部分為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)（為gERECTA序列內(nèi)固有的限制性酶切位點(diǎn)）。擴(kuò)增DgERECTA序列的上游引物P3： 5′-AGGCTCTCGCTGTACTGTAAGTACAAT-3′，下游引物P4： 5′-AGACTAGTTAATACCAGTTCCAGCATTCCAATCCCAG-3′，下劃線部分為SpeⅠ酶切位點(diǎn)。兩對(duì)gERECTA基因特異引物設(shè)計(jì)示意圖見(jiàn)圖2A。

22 水稻DgERECTA和UgERECTA片段的分離

利用兩對(duì)特異性引物分別擴(kuò)增UgERECTA和DgERECTA兩片段。根據(jù)gERECTA基因序列及兩對(duì)引物的設(shè)計(jì)位點(diǎn)，預(yù)測(cè)DgERECTA片段大小為4 510 bp，含有約300 bp的3′區(qū)域，UgERECTA片段大小為4 483 bp，含有約17 kb的5′區(qū)域。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10%（W/V）瓊脂糖凝膠電泳分離后，都分別得到一條比4 254 bp條帶稍長(zhǎng)的片段（圖2B、C），與預(yù)期結(jié)果一致。

23 重組質(zhì)粒pMD18-DgERECTA雙酶切鑒定

將DgERECTA與pMD18-T載體連接，挑取經(jīng)過(guò)Amp抗性篩選的6個(gè)單菌落，搖菌過(guò)夜后提取質(zhì)粒，用Hind Ⅲ和SpeⅠ雙酶切，10%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。預(yù)測(cè)陽(yáng)性克隆酶切后應(yīng)出現(xiàn)兩條帶，一條為2 692 bp的pMD18質(zhì)粒片段；一條為4 444 bp的DgERECTA目的片段（引物P4到Hind Ⅲ之間的長(zhǎng)度）。結(jié)果（圖3A）表明，3、5號(hào)單菌落質(zhì)粒出現(xiàn)了與預(yù)期結(jié)果相符的兩條帶，為陽(yáng)性克隆。將酶切正確的重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與已報(bào)道的序列完全匹配，并帶有完整的酶切位點(diǎn)。表明酶切檢測(cè)正確的重組克隆質(zhì)粒pMD18-DgERECTA中含有正確的目的基因片段。

24 重組質(zhì)粒pTA2-UgERECTA單酶切鑒定

將UgERECTA與pTA2-T載體連接，挑取經(jīng)過(guò)Amp抗性篩選的6個(gè)單菌落，搖菌過(guò)夜后提取質(zhì)粒，用Hind Ⅲ單酶切，10%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。預(yù)測(cè)陽(yáng)性克隆酶切后應(yīng)出現(xiàn)兩條帶，一條為2 981 bp的pTA2質(zhì)粒片段；一條為4 483 bp的UgERECTA目的片段。結(jié)果（圖3B）表明，1、4號(hào)單菌落質(zhì)粒出現(xiàn)了與預(yù)期結(jié)果相符的兩條帶，為陽(yáng)性克隆。將酶切正確的重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)結(jié)果表明插入的UgERECTA序列與已報(bào)道的序列完全匹配，并帶有完整的酶切位點(diǎn)。表明酶切檢測(cè)正確的重組克隆質(zhì)粒pTA2-UgERECTA中含有正確的目的基因片段。

25 重組表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1390-gERECTA的構(gòu)建

由于gERECTA基因片段較長(zhǎng)，直接同pCAMBIA1390載體連接較為困難。因此，我們利用gERECTA基因序列內(nèi)部的Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)和人為添加的SpeⅠ 酶切位點(diǎn)，先將DgERECTA連接到pCAMBIA1390，再利用Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)將UgERECTA連接到重組質(zhì)粒pCAMBIA1390-DgERECTA上。由于插入的UgERECTA序列帶有自身的啟動(dòng)子序列，所以gERECTA的表達(dá)受自身啟動(dòng)子的調(diào)控。

251 重組質(zhì)粒pCAMBIA1390-DgERECTA的酶切鑒定 經(jīng)Kan抗性篩選后的單菌落搖菌過(guò)夜后提取質(zhì)粒，用Hind Ⅲ和Spe Ⅰ雙酶切，10%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。預(yù)測(cè)陽(yáng)性質(zhì)粒酶切后應(yīng)出現(xiàn)兩條帶，一條為8 864 bp的pCAMBIA1390質(zhì)粒片段；一條為4 444 bp的DgERECTA目的片段。結(jié)果（圖4A）表明，1～3號(hào)單菌落質(zhì)粒出現(xiàn)了與預(yù)期結(jié)果相符的兩條帶，為陽(yáng)性重組質(zhì)粒。

252 重組質(zhì)粒pCAMBIA1390-DgERECTA-UgERECTA的酶切鑒定 由于UgERECTA目的片段同pCAMBIA1390-DgERECTA連接反應(yīng)是利用HindⅢ單一位點(diǎn)進(jìn)行連接，所以pCAMBIA1390-DgERECTA重組載體去磷酸化反應(yīng)要徹底，盡量減少載體的自連。連接反應(yīng)前利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收UgERECTA目的片段和去磷酸化后的pCAMBIA1390-DgERECTA重組載體（圖4B）。

對(duì)經(jīng)Kan抗性篩選后的單菌落搖菌過(guò)夜后提取質(zhì)粒，用Hind Ⅲ單酶切，10%（W/V）的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。預(yù)測(cè)質(zhì)粒酶切后應(yīng)出現(xiàn)兩條帶，一條為13 308 bp的pCAMBIA1390-DgERECTA質(zhì)粒片段；一條為4 483 bp的UgERECTA目的片段。結(jié)果（圖5A）表明，1、2、5、6、7號(hào)質(zhì)粒為陽(yáng)性重組質(zhì)粒。由于這步連接反應(yīng)只利用了Hind Ⅲ單一酶切位點(diǎn)，為檢測(cè)UgERECTA片段插入到pCAMBIA1390-DgERECTA重組質(zhì)粒上的方向性，我們利用SpeⅠ酶切檢測(cè)1、2、5、6、7號(hào)質(zhì)粒，預(yù)測(cè)連接方向正確的陽(yáng)性質(zhì)粒應(yīng)出現(xiàn)一條7 960 bp的條帶，連接方向顛倒的質(zhì)粒出現(xiàn)一條5 483 bp的條帶。結(jié)果（圖5B）表明，2、5、7號(hào)質(zhì)粒為連接正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒。

3 討論

近年來(lái)，全球水資源短缺境況越來(lái)越嚴(yán)重，干旱造成農(nóng)作物減產(chǎn)導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失逐年加重。植物可以通過(guò)誘導(dǎo)可溶性滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累、膨壓的維持或者耐脫水等抵抗干旱[13]，但是僅靠現(xiàn)有植物資源本身的調(diào)節(jié)能力抵御干旱已不能滿足農(nóng)業(yè)高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的需要。基因工程技術(shù)已逐漸滲透到植物的遺傳改良研究中，與傳統(tǒng)抗旱育種方法相比，基因工程以其周期短、效率高等特點(diǎn)得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

已有研究表明擬南芥ERECTA基因可以通過(guò)調(diào)控蒸騰效率來(lái)增強(qiáng)植株耐干旱脅迫的能力[11]。水稻是我國(guó)重要的糧食作物，改良水稻耐旱性是科學(xué)家育種的重要目標(biāo)之一。構(gòu)建能在水稻中表達(dá)OsERECTA基因的植物表達(dá)載體為培育抗旱水稻新品種提供了可能。為了便于研究OsERECTA基因在水稻生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，構(gòu)建OsERECTA基因植物表達(dá)載體時(shí)要排除外源啟動(dòng)子對(duì)OsERECTA基因表達(dá)的影響。Dievart和Song等證明擬南芥ERECTA基因的啟動(dòng)子可表達(dá)擬南芥CLAVATA1和LhG4基因[14，15]，是相對(duì)較強(qiáng)的啟動(dòng)子。這同Karve等認(rèn)為擬南芥ERECTA基因的上游序列作為強(qiáng)啟動(dòng)子起作用的結(jié)論一致[12]。因此，我們構(gòu)建的pCAMBIA1390-gERECTA載體攜帶的OsERECTA自身啟動(dòng)子可以保證gERECTA基因過(guò)量表達(dá)，并具有同內(nèi)源OsERECTA基因相同的表達(dá)模式，例如組織和器官特異性等，這比使用組成型啟動(dòng)子調(diào)控gERECTA基因的表達(dá)更便于研究OsERECTA基因的功能。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)基因工程技術(shù)手段，以日本晴全基因組DNA為模板，通過(guò)分段PCR擴(kuò)增，克隆亞片段再連接的策略，成功分離并構(gòu)建了包含水稻OsERECTA基因全長(zhǎng)基因組片段的植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-gERECTA，后續(xù)的基因轉(zhuǎn)化工作正在進(jìn)行，OsERECTA基因?qū)⒃谄渥陨韱?dòng)子的控制下在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)OsERECTA基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建為研究OsERECTA過(guò)表達(dá)對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境適應(yīng)性方面的影響奠定了基礎(chǔ)，也為研究水稻OsERECTA的功能奠定了基礎(chǔ)。參 考 文 獻(xiàn)：

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