周天恩　劉宏偉

目前，有關(guān)脂肪源性干細(xì)胞（Adipose—derived stem cells，ADSC）的分離和提取主要以Zuk等提出的方法為藍(lán)本（見表1），進(jìn)行改進(jìn)形成各自使用的實(shí)驗(yàn)步驟。由于實(shí)驗(yàn)室分離、提取多用于基礎(chǔ)研究，當(dāng)中獲取細(xì)胞的過程多數(shù)未能顧及臨床應(yīng)用時(shí)所考慮的問題，如：傳播動(dòng)物源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)、生產(chǎn)的時(shí)間、治療的成本等。然而，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)“From Bench to Bedside”的目標(biāo)就是將實(shí)驗(yàn)室研究的成果應(yīng)用于臨床創(chuàng)造新的療法。在此之前，必須透徹地分析每個(gè)處理細(xì)胞的步驟是否會(huì)對人體存有潛在的危害，用起來是否經(jīng)濟(jì)、是否簡便易于操作等，以便新的療法能夠服務(wù)于大眾的醫(yī)療需求。本文綜合動(dòng)物及人體來源提取脂肪源性干細(xì)胞

（Adipose-derived stem cells，ADSC）的過程，從ADSC分離、提取、擴(kuò)增三方面進(jìn)行剖析，以期為臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供參考。

1 脂肪源性基質(zhì)血管組分（SiromaJ vascularfraction，SVF）的分離步驟存在的問題

從脂肪組織分離SVF，使用的酶種類及其濃度的關(guān)系還沒有完整的研究報(bào)道?？梢杂糜谙窘M織的酶有膠原酶、分散酶、透明質(zhì)酸酶等，以膠原酶最為廣泛使用，使用的濃度有0.01%、0.075%、0.05%，尚未有統(tǒng)一。陶凱等為了了解不同膠原酶濃度、膠原酶消化時(shí)間和血清濃度對于人脂肪來源干細(xì)胞體外培養(yǎng)的不同效果，采用0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml四種不同膠原酶濃度進(jìn)行消化，最后結(jié)果是在消化1h時(shí)，2.0mg/ml組消化細(xì)胞總數(shù)最多，提示消化過程中有濃度依賴性。陳超等曾評價(jià)不同的細(xì)胞對不同酶的耐受性不同，因此，必須把握酶消化的酶濃度與消化時(shí)間，提高分離細(xì)胞的純度與存活率。如：觀察組織塊已經(jīng)分散而失去塊的形狀，形成細(xì)胞一酶混合液，可以認(rèn)為已消化充分。如果消化時(shí)間過長，培養(yǎng)瓶中的組織塊就會(huì)變成細(xì)胞碎片。

酶消化法的另一缺點(diǎn)就是存在細(xì)胞毒性，一般的消化酶有可能包含內(nèi)毒素、其他的蛋白酶、異種蛋白。針對此問題，目前研究了幾種非酶性的細(xì)胞分離法，如：熒光激活細(xì)胞分選法（Fluorescence—activated cell sorting，F(xiàn)ACS）、使用涂有特異性抗體的免疫磁珠篩選法（Immunomagnetic-bead purification）、乙醛脫氫酶的選擇表達(dá)法等。這些方法雖然避免了消化酶的細(xì)胞毒性問題，卻帶來了過高的研究成本，不便于臨床大量使用。因此，現(xiàn)有的分離法，除了要考慮是否符合GMP/GCP指南的要求，還需要更多實(shí)用的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)使之在實(shí)踐中逐步完善。

2 正確提取ADSC在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的意義

迄今為止，研究報(bào)告指出影響ADSC提取的因素大致可分為六個(gè)方面：脂肪老化程度，脂肪細(xì)胞的活性隨著患者的年齡下降，能提取ADSC的量相對減少；對吸脂部位，人體不同部位囤積的脂肪含量有別，較容易囤積脂肪的地方，如：腹部、大腿均能有效提取所需的ADSC：脂肪提取組織的粉碎程度，不同的抽脂方法會(huì)影響脂肪組織的粉碎程度，脂肪組織越細(xì)，膠原酶才能更有效消化脂肪組織并提取更多ADSC；濃度離心速度，研究表示高速離心會(huì)降低ADSC活性，但最理想的離心速度到目前為止并沒有確切的方案：SVF的凈度，抽脂后大量血細(xì)胞及纖維組織粘附在脂肪表面，雖然沒有臨床證據(jù)證明這些組織會(huì)妨礙ADSC成長，但屬貼壁性生長的ADSC在體外實(shí)驗(yàn)中顯示大量倍增需要純凈的環(huán)境；細(xì)胞存儲(chǔ)方法，不同的降溫速度及冷凍試劑都對ADSC的活性有影響，要減低對ADSC的損害并將之發(fā)展為醫(yī)療產(chǎn)業(yè)，必須積極研究有效獲取ADSC的方法。

以上因素當(dāng)中跟轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)關(guān)系最為密切的，就是SVF的凈度。從脂肪組織分離SVF后，一般實(shí)驗(yàn)室會(huì)使用生理鹽水（PBS）或紅細(xì)胞裂解液沖洗SVF，將多余的紅細(xì)胞去除免得其妨礙ADSC的貼壁生長，從而提高所提的ADSC的純度。Horn等的研究示，使用含氯化銨的紅細(xì)胞裂解液相比單核細(xì)胞密度分離更快捷提取間充質(zhì)干細(xì)胞

（mesenchymal stemcells，MSC）。報(bào)告指出，經(jīng)離心法初步分離出來的MSC混合了不同類型的基質(zhì)細(xì)胞，要找出方便、有效獨(dú)立提取ADS的方法才能減少增殖時(shí)間，迅速達(dá)到適合臨床應(yīng)用的細(xì)胞量。

使用氯化銨裂解液的唯一缺點(diǎn)就是氯化銨具細(xì)胞毒性，所以通過其提取的ADSC有可能存在違背臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用的主旨。雖然說明氯化銨對人體有何直接影響的臨床報(bào)道并不多，但曾經(jīng)有研究指出經(jīng)過氯化銨裂解后提取的ADSC存活力不高，因此，許多針對臨床研究的實(shí)驗(yàn)室都直接放棄裂解的部分。針對紅細(xì)胞裂解液在臨床使用的安全性的研究并不多，礙于氯化銨的毒性始終對人體細(xì)胞有潛在的安全威脅，對ADSC的存活力可能潛在的不良影響，要兼顧ADSC的提取效率，必須另覓有效且安全性較高的紅細(xì)胞裂解液。

最近，于春艷等的研究提出氯化銨對人體內(nèi)的自噬一溶酶體系統(tǒng)的活動(dòng)有不良影響。當(dāng)體內(nèi)出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)，包括細(xì)胞內(nèi)由于生理或病理原因而被損傷的細(xì)胞器，或過量儲(chǔ)存的糖元等，它們可被細(xì)胞自身的膜（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基復(fù)合體的膜）包裹形成自噬體（autophgosome），形成內(nèi)源性物質(zhì)囊泡。而自噬體與初級溶酶體接觸后，兩者將融合形成自噬溶酶體。該實(shí)驗(yàn)顯示，透射電鏡觀察可見在含氯化銨的環(huán)境下，自噬體與溶酶體并沒有完全融合，因此增加維生素K3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)伴有caspase非依賴細(xì)胞死亡途徑，確認(rèn)了氯化銨的細(xì)胞毒性，以及可能誘發(fā)對人體有害的機(jī)制。另外，鞏文玉等研究也報(bào)道含氯化氨的紅細(xì)胞裂解液影響細(xì)胞的表面抗原蛋白的表示，尤其使CD34不能正常表達(dá)，影響細(xì)胞計(jì)數(shù)，暗示氯化銨的細(xì)胞毒性或許影響基因排序，導(dǎo)致蛋白反應(yīng)異常。既然以上研究提出了氯化銨對細(xì)胞損害的證據(jù)，因此提取ADSC的方案必須顧及使用臨床認(rèn)可并能安全體內(nèi)吸收的溶液與試劑，如：氯化鈉溶液。另外，除了研究紅細(xì)胞裂解的新方法，還應(yīng)該積極探索其他提高ADSC純凈度的方法，如：多次沖洗或應(yīng)用簡單的滲透原理減少多余的紅細(xì)胞。

3 體外培養(yǎng)ADSC主要面對的安全問題

3.1 動(dòng)物源性疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)：胎牛血清（FoetalBovine Serum，F(xiàn)BS）被廣泛使用于ADSC擴(kuò)增與分化的步驟中，但這種方法在理論上存在傳播動(dòng)物源性傳染?。╞ovine spongiform encephalopathy，BSE）及導(dǎo)致血清病的風(fēng)險(xiǎn)。雖然研究表示新生牛血清跟胎牛血清培養(yǎng)基均對ADSC的質(zhì)量與產(chǎn)量有正面影響，但是FBS蛋白跟ADSC蛋白有可能在培養(yǎng)基中結(jié)合，到臨床使用時(shí)有機(jī)會(huì)傳播病毒或病毒性疾病、誘發(fā)異種免疫反應(yīng)，甚至即時(shí)排斥的免疫反應(yīng)，對患者的生命存在威脅。鑒于此類問題的存在，有研究報(bào)道提出使用人的血清或血小板源性產(chǎn)品作為培養(yǎng)基的可能性，目的是把細(xì)胞產(chǎn)品人源化以穩(wěn)定細(xì)胞產(chǎn)品的活力，同時(shí)杜絕動(dòng)物源性疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

除此以外，科學(xué)家們正積極研究可否采用無血清的培養(yǎng)方法。無血清培養(yǎng)基（serum freemedium，SFM）顧名思義不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長、繁殖的合成培養(yǎng)基。由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子，如：纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細(xì)胞以懸浮形式生長。SFM不但可避免血清對細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染，還可避免血清批次間的質(zhì)量變動(dòng)，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性，有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化；缺點(diǎn)主要是成本高，以及懸浮細(xì)胞易受某些機(jī)械因素和化學(xué)因素的影響。

3.2 低溫儲(chǔ)存ADSC的潛在風(fēng)險(xiǎn)：液氮深低溫保存對ADSC擴(kuò)增及分化能力沒有明顯影響。不過，有關(guān)如何最大限度保存ADSC的生物特性則有賴于合適的冷凍保護(hù)劑和對應(yīng)的培養(yǎng)基。Martinello等在犬ADSC低溫賦存研究中證實(shí)長期保存（1年）并不影響ASCs的MSC特性，但會(huì)使ADSC的增殖率和端粒酶的活性降低；類似的結(jié)果也在大鼠及人ADSC中發(fā)現(xiàn)。為加快ADSC的臨床應(yīng)用，必須有效長期保存ADSC能夠以供患者日后不時(shí)之需。常規(guī)冷凍法，又名逐步冷凍法，進(jìn)行冷凍前需要在培養(yǎng)基中置入不同的冷凍保護(hù)劑，如：二甲亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），不僅有細(xì)胞毒性，還能以時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞走向凋亡（apoptosis）；解凍時(shí)則需要置入含血清的PBS徹底脫除冷凍保護(hù)劑，引申上述的動(dòng)物源性疾病問題。不少研究比較不同的冷凍保護(hù)劑，也提出過新的保護(hù)劑取代DMSO，如：聚乙烯吡咯烷（polyvinylpyrrolidon，PVP），CELLBANKER2，但最近Miyamoto等表示最可行的保存ADSC的辦法，是在培養(yǎng)基中加入絲膠蛋白（sericin），因其含有豐富絲氨酸，在脂肪和脂肪酸的新陳代謝中發(fā)揮重要作用，解凍后的ADSC存活率高達(dá)95%。另外，也有研究使用開放式拉長塑料細(xì)管法保存ADSC。可是其存量少，即使細(xì)胞復(fù)原率相對較高，不適宜大規(guī)模應(yīng)用。而且，開放式暗示細(xì)胞接觸液氮的機(jī)會(huì)率高，很容易造成污染，對日后使用者產(chǎn)生威脅。

上述方法雖然能應(yīng)對目前ADSC的需求，可是要大量儲(chǔ)存以應(yīng)對未來再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，必須更進(jìn)一步研究低成本又方便存取的儲(chǔ)存方法，確保ADSC有穩(wěn)定性高的復(fù)原率和存活率，才能使患者受益。

3.3 缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)程序：細(xì)胞的生產(chǎn)程序必須確保細(xì)胞產(chǎn)品的重復(fù)性和可靠性，才能投入量化生產(chǎn)并使之應(yīng)用普及。目前絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用幾個(gè)常規(guī)的步驟處理脂肪組織來源的細(xì)胞。這些步驟包括：PBS沖洗、酶消化或機(jī)械破碎脂肪組織、離心以便分離出可供直接使用或低溫貯藏的SVF，或者培養(yǎng)擴(kuò)增以產(chǎn)生ASCs。雖然有關(guān)如何提取ADSC的理論越來越成熟，但是現(xiàn)有的研究必須考慮其出處是否符合藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（Good ManufacturePraetices，GMP），以及藥物臨床試驗(yàn)管理規(guī)范（Good clinic Practices，GMP）實(shí)踐指南的要求。GMP/GCP要求嚴(yán)格登記細(xì)胞生產(chǎn)過程中的操作步驟，而且所使用的設(shè)備必須有合資格的認(rèn)證，符合這兩個(gè)條件的研究成果的可信度和實(shí)際應(yīng)用能力較高，相對臨床參考價(jià)值也更大。

目前，ADSC在人體的臨床應(yīng)用還處于早期階段，缺乏循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)。因此，實(shí)行大規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)前，有必要在早期的臨床研究中，有計(jì)劃地開展隨機(jī)雙盲對照實(shí)驗(yàn)，為最終的循證醫(yī)學(xué)分析積累資料。這需要多中心研究單位共同協(xié)調(diào)與規(guī)劃，將有關(guān)ADSC的動(dòng)物研究數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移到人體，找出ADSC于人體的相關(guān)指標(biāo)，才能保證ADSC的安全應(yīng)用，并有望普及以ADSC為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法。

4 小結(jié)

雖然目前的技術(shù)都可以大規(guī)模擴(kuò)增ADSC并保持其生物特性，但是臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用ADSC必須盡最大可能避免潛在的危險(xiǎn)性，防止誘發(fā)其他疾病或損害。實(shí)行患者利益導(dǎo)向政策，確保沒有產(chǎn)生后遺癥或副作用的操作工序，尋找快捷且低成本的方法獲取ADSC，使細(xì)胞治療能夠普遍應(yīng)用，最終惠及民生。根據(jù)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的原則，要把基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化為可在臨床實(shí)際應(yīng)用的產(chǎn)品，除了必須準(zhǔn)確地判斷和預(yù)該產(chǎn)品的安全性及有效性，還需要在重復(fù)生產(chǎn)時(shí)達(dá)到一定的穩(wěn)定性，才能將創(chuàng)新的科研成果用作醫(yī)療手段。為此，需要全球各實(shí)驗(yàn)室通力合作，制定一個(gè)規(guī)范的程序使其分離、提取、培養(yǎng)、儲(chǔ)存中每一個(gè)步驟都標(biāo)準(zhǔn)化以便監(jiān)管，逐漸使ADSC的生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，避免研發(fā)投入與支出失衡。要將ADSC應(yīng)用于臨床治療，ADSC應(yīng)該符合以下四個(gè)條件：①可以于異體安全及有效地使用，減低患者負(fù)擔(dān)；②遵從國際認(rèn)可規(guī)程分離、提取、擴(kuò)增ADSC使質(zhì)量得到控制和保證；③大規(guī)模體外生產(chǎn)制造ADSC的實(shí)踐指南降低成本；④允許調(diào)控ADSC分化的方向及進(jìn)程并重復(fù)培養(yǎng)結(jié)果。