運(yùn)慧媛　袁夢(mèng)桐　劉明月　王鈺瑩　繆宏穎

[摘要]目的：研究辛伐他汀對(duì)人牙髓干細(xì)胞成骨活性的影響。方法：將體外分離培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞分別接種于含有不同濃度辛伐他汀的礦化培養(yǎng)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)，測(cè)定堿性磷酸酶活性及骨唾液酸蛋白基因的表達(dá)情況。結(jié)果：與對(duì)照組比較，適宜濃度辛伐他汀（1×10^-6mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-8mol/L）促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的成骨活性作用更為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），當(dāng)辛伐他汀濃度為1×10^-7mol/L時(shí)，促進(jìn)作用最顯著。結(jié)論：適宜濃度的辛伐他汀可以有效促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的成骨活性。

[關(guān)鍵詞]牙髓干細(xì)胞；辛伐他?。怀晒腔钚?/p>

[中圖分類號(hào)]Q813.1 R782.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）06-0644-04

辛伐他汀為一種無(wú)活性的內(nèi)酯類結(jié)構(gòu)藥物，口服后在肝臟中吸收，主要水解為相應(yīng)的β-羥酸，此結(jié)構(gòu)是催化膽固醇合成的早期限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A reductase，HMG-CoA）還原酶的抑制劑。辛伐他汀臨床常用于控制血液中膽固醇的含量以及預(yù)防心血管疾病的發(fā)生。與相同劑量的洛伐他?。╨ovastatin）、普伐他汀（pravastatin）和氟伐他?。╢luvastatin）等其他HMG-CoA還原酶抑制劑相比，辛伐他汀可以更有效地降低血清中的總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-cholesterol）的含量，臨床療效更為顯著。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀亦具有促細(xì)胞成骨分化的功能，為辛伐他汀的臨床應(yīng)用開(kāi)辟了新的領(lǐng)域。Mundy等通過(guò)熒光素酶標(biāo)記基因轉(zhuǎn)染等多種實(shí)驗(yàn)途徑，首次驗(yàn)證了辛伐他汀的體內(nèi)及體外促成骨活性。2009年，Okayama等實(shí)驗(yàn)證明辛伐他汀能激活BMP-2的啟動(dòng)子，誘導(dǎo)BMP-2 mRNA和蛋白的表達(dá)，提示其具有刺激骨形成的作用。人牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）可向成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞等多種細(xì)胞分化，擁有多向分化的潛能，它可以作為一種組織工程的種子細(xì)胞。組織工程修復(fù)牙體及頜骨缺損一直以來(lái)是口腔修復(fù)的目標(biāo)，人牙髓干細(xì)胞作為一種組織來(lái)源更為接近的種子細(xì)胞，口腔科組織工程應(yīng)用更具優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)旨在證明人牙髓干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的可行性，為牙體及頜骨缺損的組織工程修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料：胎牛血清（Hyclone，美國(guó)）；DMEM F/12（Gibco，美國(guó)）培養(yǎng)基；I型膠原酶（Gibco，美國(guó)）；胰酶（碧云天生物技術(shù)研究所，上海）；青鏈霉素（碧云天生物技術(shù)研究所，上海）；PBS緩沖溶液；抗壞血酸（sigma，美國(guó)）；β-甘油磷酸鈉（sigma，美國(guó)）；L-谷氨酰胺（sigma，美國(guó)）；茜素紅（sigma，美國(guó)）；堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）；辛伐他?。╯igma，美國(guó)）；Triton X-100（碧云天生物技術(shù)研究所，上海）。TRNzol總RNA提取試劑（天根生化科技有限公司，北京）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Bioneer，韓國(guó)）；PCR試劑盒（創(chuàng)奇，北京）

1.2 方法

1.2.1 DPSCs分離培養(yǎng)及傳代：選擇哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔外科門診采集的因正畸拔除的正常前磨牙或阻生的正常第三磨牙（患者14～25歲），所有成年患者及未成年患者家屬均知情同意。依據(jù)Gronthos DPSCs原代細(xì)胞培養(yǎng)法，劈開(kāi)實(shí)驗(yàn)牙，用鑷子取出牙髓，含雙抗PBS充分沖洗，置于體積分?jǐn)?shù)為0.3%的I型膠原酶和0.4%的分散酶（1：1）37℃橫濕振蕩器內(nèi)消化1h，200目尼龍篩過(guò)濾懸液至10ml離心管中，1000rpm離心5min，棄上清，加入含20%FBS培養(yǎng)基，吹打混勻，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)以1×10⁸個(gè)/L細(xì)胞接種至50ml培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO₂恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每周換液兩次，細(xì)胞融合達(dá)80%后，0.25%胰蛋白酶消化，1：2比例傳代。

1.2.2 DPSCs鑒定

1.2.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定：倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和形態(tài)特征。

1.2.2.2 礦化結(jié)節(jié)鑒定：將第三代人DPSCs以1×10⁵個(gè)/孔接種于六孔板中，12h后，各孔換為礦化培養(yǎng)液（DMEM F/12培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素、100μmol/L抗壞血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉，2mmol/L L-谷氨酰）繼續(xù)培養(yǎng)14天后進(jìn)行茜素紅染色，培養(yǎng)皿PBS緩沖液沖洗3遍，95%無(wú)水乙醇固定15min，蒸餾水沖洗3次，0.1%茜素紅-Tris—HCI（pH=8.3）37℃孵育30min，蒸餾水輕輕沖洗，干燥，照相。

1.2.3 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性測(cè)定：將第三代人DPSCs以5×10³個(gè)/孔接種在九十六孔板中，12h后，各孔換為礦化培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)分A、B、C、D四組，各組辛伐他汀濃度為A組：1×10^-6mol/L；B組：1×10^-7mol/L：C組：1×10^-8mol/L；D組：0 mol/L。每組各10孔，繼續(xù)培養(yǎng)3天，去除培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，0.01mol/L PBS沖洗細(xì)胞3次，加入50μl 0.1%Triton X-100，4℃冰箱過(guò)夜，光鏡下觀察已無(wú)明顯細(xì)胞結(jié)構(gòu)，反復(fù)吹打后每個(gè)樣本加入ALP緩沖液和基質(zhì)液各50μl，充分混勻，37℃水浴15min，加入顯色劑150μl，在酶標(biāo)儀上選擇520nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度（A）值，觀察各組細(xì)胞ALP活性。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測(cè)骨唾液酸蛋白基因表達(dá)：將第三代人DPSCs以1×105個(gè)/孔接種于六孔板中，12h后，各孔換為礦化培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)分A、B、C、D四組，各組辛伐他汀濃度為A組：1×10^-6mol/L；B組：1×10^-7mol/L：C組：1×10^-8mol/L；D組：0mol/L。每組樣本量為3，繼續(xù)培養(yǎng)7天后進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。依據(jù)操作手冊(cè)使用Trizol試劑裂解細(xì)胞，提取總mRNA。參照RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明書(shū)將總mRNA依次按70℃5min、50℃ 1h、95℃5min逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件為：94℃2min預(yù)變性后，94℃ 30s、48.2℃30s、72℃ 30s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 2min延伸，4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)分析。以電泳條帶的強(qiáng)度×面積求得基因表達(dá)量，將基因表達(dá)量除以管家基因表達(dá)量求得基因陽(yáng)性表達(dá)水平。RT-PCR引物序列（見(jiàn)表1）。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：使用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式描述。

對(duì)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 DPSCs光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：DPSCs原代培養(yǎng)24h內(nèi)細(xì)胞貼壁緩慢，可見(jiàn)細(xì)胞為梭形，形態(tài)較小，未完全伸展，且有少量懸浮未貼壁細(xì)胞。48h，細(xì)胞梭形，貼壁較多，少量細(xì)胞呈克隆團(tuán)狀生長(zhǎng)（見(jiàn)圖1）。7天后可見(jiàn)DPSCs大量擴(kuò)增，呈伸展長(zhǎng)梭形，克隆團(tuán)狀聚集生長(zhǎng)，細(xì)胞融合率可達(dá)80%（見(jiàn)圖2）。

2.2 礦化結(jié)節(jié)鑒定：DPSCs 14天培養(yǎng)后，可見(jiàn)部分細(xì)胞發(fā)生成骨細(xì)胞樣多角形以及錐體形態(tài)改變。DPSCs在礦化誘導(dǎo)后逐漸產(chǎn)生白色點(diǎn)狀晶體。經(jīng)茜素紅染色后光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)橘紅色礦化結(jié)節(jié)，呈團(tuán)狀不規(guī)則形態(tài)（見(jiàn)圖3）。

2.3 辛伐他汀對(duì)DPSCs堿性磷酸酶活性的影響：在礦化誘導(dǎo)條件下，辛伐他汀對(duì)人牙髓干細(xì)胞ALP活性有促進(jìn)作用，1×10^-6mol/L、1×10^-7mol/L、1×10^-8mol/L組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中1×10^-7mol/L組對(duì)ALP活性的影響最顯著（見(jiàn)表2）。

2.4 辛伐他汀對(duì)DPSCs BSP表達(dá)的影響：與對(duì)照組比較，各組BSP表達(dá)均較高。其中，辛伐他汀濃度為1×10^-7mol/L時(shí)，BSP表達(dá)量最高（見(jiàn)表3）。

3 討論

多項(xiàng)體內(nèi)及體外的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀具有明顯的促進(jìn)骨形成的作用。2001年，Meada等發(fā)表文章，研究辛伐他汀作用下，非轉(zhuǎn)化成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1和鼠骨髓細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀提高成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性并促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)形成，此效應(yīng)呈時(shí)間、劑量依賴性。胡飛等研究辛伐他汀對(duì)人牙周膜細(xì)胞成骨活性的影響，證明適宜濃度辛伐他汀提高了人牙周膜細(xì)胞ALP活性和骨橋蛋白的表達(dá)，有效促進(jìn)了人牙周膜細(xì)胞的成骨活性。Chan等統(tǒng)計(jì)分析表明，服用他汀類藥物可增加股骨頸骨密度，長(zhǎng)期服用降低老年婦女發(fā)生非病理性骨折的危險(xiǎn)性。張曉艷等利用含有β-甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C的條件培養(yǎng)液，成功誘導(dǎo)人前磨牙牙髓干細(xì)胞向成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的分化，充分說(shuō)明人牙髓干細(xì)胞的骨向分化潛能，為人牙髓干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

ALP是一種分泌型蛋白，它的表達(dá)是成骨細(xì)胞分化的主要特征之一，是基質(zhì)成熟的早期標(biāo)志物。其主要作用是水解胞漿中的有機(jī)磷酸釋放出無(wú)機(jī)磷，促使基質(zhì)礦化。測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ALP活性變化作為一種常用的手段用于細(xì)胞成骨分化程度和細(xì)胞礦化能力的檢測(cè)。當(dāng)成骨細(xì)胞進(jìn)入礦化期，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性下降，而此時(shí)與細(xì)胞外基質(zhì)中羥基磷灰石沉積相關(guān)的基因表達(dá)達(dá)到高峰，如骨橋蛋白、骨鈣素、骨唾液酸蛋白基因。骨唾液酸蛋白由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞以及其他一些骨相關(guān)細(xì)胞合成和分泌，其表達(dá)局限于礦化組織中。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ALP試劑盒、RT—PCR法觀察辛伐他汀作用后，人DPSCs礦化能力的改變。結(jié)果表明辛伐他汀濃度在1×10^-8mol/L～1×10^-6mol/L范圍內(nèi)，與對(duì)照組比較，ALP活性及BSP基因的表達(dá)量均提高，當(dāng)辛伐他汀濃度為1×10^-7mol/L時(shí)，促進(jìn)作用最明顯，證實(shí)辛伐他汀誘導(dǎo)人DPSCs是一種可行、有效的促進(jìn)成骨活性的方法，與以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同。但辛伐他汀的有效作用濃度各實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不盡相同，可能與細(xì)胞種類、培養(yǎng)方法及培養(yǎng)環(huán)境相關(guān)，還有待進(jìn)一步的研究。