劉玉芬　夏海濤

摘要：以乙醇溶液為提取溶劑從佛手（Citrus medica var. sarcodactylis）中提取總黃酮，在單因素試驗的基礎(chǔ)上以佛手總黃酮提取率為指標(biāo)，選擇提取溫度、提取時間和液料比3個因素進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗，優(yōu)化佛手總黃酮的提取工藝條件。結(jié)果表明，優(yōu)化的提取工藝條件為體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作提取溶劑、提取溫度69 ℃、提取時間1.9 h、液料比V乙醇∶m佛手粉=32∶1 （mL/g）、提取2次，該條件下佛手總黃酮提取率為0.565 9%。

關(guān)鍵詞：佛手（Citrus medica var. sarcodactylis）；總黃酮；提取工藝；響應(yīng)面法

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）07-1634-04

佛手（Citrus medica var. sarcodactylis）又名佛手柑，為常綠小喬木或灌木，是蕓香科柑橘屬植物香櫞（C. medica）的變種，主要分布在我國浙江、廣東、廣西、福建、云南、四川和安徽等地，是傳統(tǒng)的名貴中藥材，全株均可入藥[1-3]。佛手果性味辛、苦、甘、溫，無毒，入肝、脾、胃、肺經(jīng)，具有和胃健脾、舒肝理氣、止咳化痰之功效，主治肝郁氣滯、飲食不振、胃腹脹滿、嘔吐、咳嗽痰多、婦科疾病等[4-6]。研究表明佛手果中主要含有蛋白質(zhì)、維生素、黃酮、多糖、香豆素類及其聚合體、有機(jī)酸、揮發(fā)油、礦物質(zhì)等化學(xué)成分[7-11]，對防治胃癌、肝癌、肺癌，抑制腫瘤生長，擴(kuò)張冠狀血管、增加冠脈的血流量，減緩心率和降低血壓，激活免疫細(xì)胞、改善機(jī)體免疫功能等也具有一定的功效[12-14]。目前對采用超聲波法等對佛手總黃酮進(jìn)行提取的研究已有報道[15，16]。本研究以乙醇溶液為浸提溶劑，在單因素試驗的基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面法對佛手總黃酮提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步開發(fā)佛手產(chǎn)品和深入研究佛手化學(xué)成分的藥理作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中藥佛手原產(chǎn)地為廣東，購自安徽省亳州市藥材市場，在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60 ℃烘干至恒重，粉碎過20目篩。用石油醚浸泡去色，重復(fù)3次，余下的固體粉末揮發(fā)干備用。乙醇、石油醚等試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（上海），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自中國藥品生物制品鑒定所。

主要試驗設(shè)備有UV-2550型紫外分光光度計（日本島津公司）、RE-5285A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）、TDL-4型臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 佛手總黃酮提取工藝流程 稱取佛手干粉5 g，置于三口瓶中，按試驗設(shè)計條件加入一定量的乙醇溶液在一定溫度下浸泡提取一定時間，離心并收集提取液，減壓濃縮后定容，測定提取液中的總黃酮含量。

1.2.2 佛手總黃酮提取率的測定 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，參照文獻(xiàn)[17]得到蘆丁質(zhì)量濃度（C）在5～40 mg/L范圍內(nèi)對其在363 nm波長處吸光度（A）的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為A=0.005 6+0.029 0C，r=0.999 8。測定佛手總黃酮提取液的吸光度A363 nm，計算其中的總黃酮含量，由下式得到佛手總黃酮的提取率。

佛手總黃酮提取率=提取液中總黃酮含量×稀釋倍數(shù)×體積/原料質(zhì)量×100%。

1.2.3 單因素試驗 設(shè)置單因素試驗分別考察乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、液料比（V乙醇∶m佛手粉，mL/g，下同）、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)對佛手總黃酮提取率的影響。①乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)。在提取溫度70 ℃、提取時間1 h、液料比25∶1、提取1次的條件下，分別以體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液作為提取溶劑。②提取時間。在提取溫度70 ℃、液料比25∶1、提取1次、體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作提取溶劑的條件下，提取時間分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h。③提取溫度。在液料比25∶1、提取1次、體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作提取溶劑、提取時間1 h的條件下，提取溫度分別為50、60、70、80、90 ℃。④液料比。在提取1次、體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作提取溶劑、提取時間1 h、提取溫度70 ℃的條件下，液料比分別為10∶1、20∶1、25∶1、30∶1、40∶1。⑤提取次數(shù)。在①～④優(yōu)化的條件下分別提取1、2、3次。

1.2.4 Box-Behnken 試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上確定Box-Behnken設(shè)計的自變量，以佛手總黃酮提取率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗因素水平編碼設(shè)計見表1，數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.05統(tǒng)計軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對佛手總黃酮提取率的影響 在提取溫度70 ℃、提取時間1 h、液料比25∶1、提取1次的條件下，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液提取總黃酮，結(jié)果見圖1。由圖1可知，佛手總黃酮提取率隨乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增大先升高，在乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)為60%時總黃酮提取率最高，之后再增加乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)，總黃酮提取率下降。乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)過高時會使脂溶性和醇溶性雜質(zhì)溶出量增大，導(dǎo)致總黃酮提取率下降，故乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)選擇60%為宜。

2.1.2 提取時間對佛手總黃酮提取率的影響 以體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作為提取溶劑，考察不同提取時間對總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，總黃酮提取率隨提取時間的延長先升高，提取時間超過2.0 h時總黃酮提取率不再升高，反而略有下降，因此，提取時間不能過長，以2.0 h為宜。

2.1.3 提取溫度對佛手總黃酮提取率的影響 提取溫度對總黃酮提取率的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，總黃酮提取率隨著提取溫度的升高呈先升高后下降的趨勢，提取溫度為70 ℃時總黃酮提取率最高，提取溫度過低不利于黃酮類物質(zhì)的溶出，溫度過高則有可能導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)被分解，因此提取溫度以70 ℃左右為宜。

2.1.4 液料比對佛手總黃酮提取率的影響 不同液料比對總黃酮提取率的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，佛手總黃酮提取率隨提取溶劑用量的增大也呈先升高后下降的趨勢，V乙醇∶m佛手粉=30∶1 （mL/g）時總黃酮提取率最大。提取溶劑用量少則黃酮提取不完全，而溶劑用量增大會導(dǎo)致成本增加，因此以V乙醇∶m佛手粉=30∶1為宜。

2.1.5 提取次數(shù)對佛手總黃酮提取率的影響 提取次數(shù)對總黃酮提取率的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，總黃酮提取率隨提取次數(shù)的增加呈上升趨勢，但提取次數(shù)由2次增加到3次，總黃酮提取率升高的幅度不大，綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素及減少操作環(huán)節(jié)，以重復(fù)提取2次為宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

在單因素試驗基礎(chǔ)上設(shè)計響應(yīng)面試驗進(jìn)一步考察提取溫度、提取時間和液料比3個因素對佛手總黃酮提取率的影響，結(jié)果見表2。將所得的試驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.05軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到總黃酮提取率對提取溫度（A）、提取時間（B）、液料比（C）的二次多項回歸方程Y=0.566 0

-0.009 2A-0.005 7B+0.007 7C-0.007 6AB+0.012 7AC-0.004 8BC-0.025 6A2-0.033 7B2-0.016 1C2。對該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，模型P<0.000 1，表明響應(yīng)回歸模型達(dá)到了極顯著水平，失擬項P=0.638 5>0.05，不顯著，模型的校正確定系數(shù)R2=0.992 1，修正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.981 9，表明該方程較好地反映了提取溫度、提取時間和液料比對佛手總黃酮提取率的影響，可用此模型對佛手總黃酮的提取進(jìn)行分析和預(yù)測。由方差分析結(jié)果知，除交互項BC對總黃酮提取率影響顯著（P<0.05）外，其他項的影響均達(dá)極顯著水平（P<0.01）。

回歸模型的響應(yīng)曲面見圖6。在所選試驗條件范圍內(nèi)存在響應(yīng)面最高點(diǎn)。由圖6a可知，當(dāng)液料比固定為30∶1時，總黃酮提取率隨提取溫度和時間的增加先呈上升趨勢，提取溫度和時間分別為68.47 ℃和1.94 h時總黃酮提取率最大，此后有所下降。高溫環(huán)境下黃酮類物質(zhì)易于氧化，結(jié)構(gòu)被破壞，提取時間過長，黃酮浸出率達(dá)到動態(tài)平衡，雜質(zhì)的溶出量增加，也導(dǎo)致總黃酮提取率下降。由圖6b可知，固定提取時間為2 h，在V乙醇∶m佛手粉=32.12∶1（mL/g）、溫度為68.37 ℃時可以達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)。圖6c表明固定提取溫度為70 ℃，在V乙醇∶m佛手粉=32.65∶1（mL/g）、提取時間為1.87 h附近可以達(dá)到響應(yīng)值最高點(diǎn)。各兩因素交互作用的等高線均呈橢圓形，表明各兩因素交互作用較強(qiáng)，影響顯著[18]。

通過軟件Design-Expert求解回歸方程，得到佛手總黃酮的最佳提取工藝條件為提取溫度68.85 ℃、提取時間1.91 h、V乙醇∶m佛手粉=32.06∶1（mL/g），佛手總黃酮提取率理論最高值可達(dá)0.567 5%?？紤]實(shí)際操作情況，將試驗條件修改為提取溫度69 ℃、提取時間1.9 h、V乙醇∶m佛手粉=32∶1（mL/g）。在此條件下以體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液作提取溶劑，提取2次，重復(fù)3次，所得佛手總黃酮提取率為0.565 9%，與預(yù)測值偏差很小，證明該模型用于優(yōu)化篩選佛手總黃酮提取工藝是可行的。

3 小結(jié)與討論

在單因素試驗基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法建立了佛手總黃酮提取率與提取溫度、提取時間和液料比的二次多項回歸模型，優(yōu)化得到的最佳提取工藝修正條件為提取溫度69 ℃、提取時間1.9 h、V乙醇∶m佛手粉=32∶1（mL/g）。經(jīng)驗證該模型擬合程度高，準(zhǔn)確有效。在此條件下得到的實(shí)際佛手總黃酮提取率與預(yù)測值基本吻合，說明Box-Behnken 設(shè)計法用于中藥佛手中總黃酮提取工藝的優(yōu)化是可行的。

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