摘 要：白念珠菌（Candida albicans）是臨床上引起系統(tǒng)真菌感染的主要病原真菌，在白念珠菌臨床鑒定和基因組功能研究中，通常要提取其基因組DNA以進(jìn)行PCR。以白念珠菌菌落為材料，通過(guò)蝸牛酶處理后直接進(jìn)行PCR，從而建立一種簡(jiǎn)捷快速的PCR模板獲取方法。結(jié)果表明，該方法避免了提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA的過(guò)程，可以大大提高工作效率。

關(guān)鍵詞：白念珠菌；菌落PCR；基因敲除；基因型驗(yàn)證

中圖分類號(hào)：R379.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.07.003

Establishment and Application of Colony PCR Method in Candida albicans

LI Xi-chuan

（Basic Medical Research Center， Tianjin Medical University， Tianjin 300070， China）

Abstract： Candida albicans was the most clinically important human fungal pathogen and causes system fungal infections. The preparation of Candida albicans genomic DNA was necessary in the clinical identification and genome functional research. Here， a rapid colony PCR method by using the snailase treatment of Candida albicans colony was described. The results showed that this method could largely increase working efficiency by avoiding the preparation of genomic DNA.

Key words： Candida albicans； colony PCR； gene disruption； genotype confirmation

白念珠菌（Candida albicans）是臨床上最常見(jiàn)的機(jī)會(huì)型致病真菌，人體系統(tǒng)真菌感染主要是由白念珠菌引起的[1-2]。然而， 目前用于臨床治療系統(tǒng)真菌感染的藥物數(shù)量有限， 而且菌株耐藥性現(xiàn)象日趨加重。因此，對(duì)白念珠菌基因功能的研究近年來(lái)得到人們的普遍重視，這將為抗真菌藥物新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供重要線索。人們對(duì)白念珠菌基因功能的了解通常通過(guò)傳統(tǒng)的遺傳學(xué)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)， 即敲除目的基因然后觀察基因缺失株的表型以發(fā)現(xiàn)該基因的功能。白念珠菌是雙倍體， 通常需要分兩步敲除兩個(gè)等位基因（alleles）才能最終獲得一個(gè)目的基因的純合缺失突變體（homozygous mutant）。常用的敲除基因的方法有兩種，一是1993年由Fonzi創(chuàng)立的“URA-BLASTER”法， 目前仍被廣泛使用[3-4]，二是直接PCR擴(kuò)增含有標(biāo)記基因的DNA片斷， 引入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行同源重組[5-7]。在使用這兩種方法敲除基因的過(guò)程中，需要先后兩次PCR檢測(cè)敲除轉(zhuǎn)化子的基因型，從而篩選到目標(biāo)基因的雜合缺失突變體（heterozygous mutant）和純合缺失突變體。由于白念珠菌轉(zhuǎn)化效率的局限性， 經(jīng)常需要通過(guò)PCR檢測(cè)幾十個(gè)甚至于上百個(gè)轉(zhuǎn)化子的基因型才能得到一個(gè)正確的目標(biāo)基因缺失突變體。因此，在轉(zhuǎn)化子基因型驗(yàn)證試驗(yàn)中，按照傳統(tǒng)的PCR方法，需要使用玻璃珠加酚/氯仿抽提法提取大量轉(zhuǎn)化子的基因組DNA做模板。這種方法工作量大，用時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，嚴(yán)重限制了基因敲除效率的提高。此外，酚和氯仿對(duì)人體有毒害作用，試驗(yàn)后留下的殘留物處理不當(dāng)會(huì)污染環(huán)境。

在真核模式生物釀酒酵母菌（Saccharomycease cerevisiae）的基因敲除工作中，人們已經(jīng)建立了簡(jiǎn)捷、高效的菌落PCR方法用于菌株的基因型驗(yàn)證[8-10]。該方法從平板上挑取單菌落，通過(guò)簡(jiǎn)單處理后直接用于PCR，避免了提取基因組DNA的過(guò)程。但是，到目前為止在白念珠菌基因敲除過(guò)程中尚無(wú)采用菌落PCR方法檢測(cè)基因型的報(bào)道。本研究在參考釀酒酵母菌的菌落PCR方法的基礎(chǔ)上，首次建立了白念珠菌的菌落PCR方法。該方法具有操作簡(jiǎn)捷、成本低廉且無(wú)環(huán)境污染的優(yōu)點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與引物 白念珠菌野生型菌株SC5314，RM1000和CaTCO89基因的純合缺失株（tco89Δ/tco89Δ）分別來(lái)自以前研究[4， 11]， rck2Δ/rck2Δ和ipf7530.2Δ/ipf7530.2Δ缺失株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。本試驗(yàn)中用到的所有引物由北京奧科生物技術(shù)公司合成。擴(kuò)增IPF7530.2基因的900 bp片段的引物是IPF7530-IF （5 CGCGAGCTCT GTTGACCAGA GGAGGAA 3） 和IPF7530-IR （5 GGGGTACCAT GGTTGCTGCA TTGAC 3）， 檢測(cè)IPF7530.2/ipf7530.2：：hisG的基因型的引物是IPF7530-DF（5 CTGGAGGAGA GCAAAGACG 3）和IPF7530-IR。擴(kuò)增全長(zhǎng)2.8 Kb CaRCK2基因的引物是CaRCK2-F （5 GCGGATCCAA TATACGCTCC CCTTTGCG 3）和CaRCK2-R （5 GCGAATTCGG TTTACTCTC TTTGAGTAGG 3）。擴(kuò)增全長(zhǎng)3.4 Kb CaTCO89基因的引物CaTCO89-F和CaTCO89-R來(lái)自以前的工作[4]。

1.1.2 主要儀器與試劑 PCR儀為Eppendorf Mastercycler Gradient，離心機(jī)為Eppendorf 5810R，酸洗玻璃珠為Sigma分裝，蝸牛酶購(gòu)自天津華生生物科技有限公司，Taq酶和500 bp DNA ladder marker購(gòu)自天津潤(rùn)泰科技發(fā)展有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 蝸牛酶處理 從固體YPD平板上挑取一個(gè)新鮮的白念珠菌單菌落，懸于200 μL 無(wú)菌水中，蝸旋混勻，5 000 rpm×1 min離心回收細(xì)胞。用200 μL Buffer A（100 mmoL·L-1 Tris HCl，10 mmoL·L-1 DTT，pH值9.4）重懸細(xì)胞，30 ℃搖床搖20 min，離心回收細(xì)胞。再用200 μL Buffer B（1.2 mmoL·L-1 sorbitol， 20 mmoL·L-1 potassium phosphate buffer， pH值 6.8）重懸細(xì)胞，渦旋混勻后離心回收，重復(fù)1次。用100 μL蝸牛酶溶液（蝸牛酶溶于Buffer B至終濃度10 mg·mL-1）重懸細(xì)胞，37 ℃水浴1 h。將酶解液放在100 ℃水中煮5 min，置于冰水浴中冷卻后，直接用于PCR。

1.2.2 PCR 反應(yīng)的配樣體系與反應(yīng)程序 每100 μL PCR反應(yīng)體系中加入2 μL上述煮過(guò)的細(xì)胞酶解液做模板，其他組分與普通PCR無(wú)差別。反應(yīng)程序中循環(huán)數(shù)設(shè)為35。

1.2.3 單菌落細(xì)胞處理 傳統(tǒng)玻璃珠加苯酚/氯仿抽提法提取白念珠菌細(xì)胞基因組DNA按以前方法[12]。為了尋找白念珠菌菌落PCR的最佳方案，用下面5種方法從單菌落細(xì)胞中制備PCR模板：⑴直接挑取少許單菌落細(xì)胞于PCR管中；⑵挑取一個(gè)單菌落重懸于300 μL水中，沸水煮5 min后的細(xì)胞液；⑶玻璃珠破碎的單菌落細(xì)胞懸液；⑷按以上1.2.1方法蝸牛酶處理過(guò)但不經(jīng)沸水煮過(guò)的細(xì)胞；⑸經(jīng)蝸牛酶處理和沸水煮過(guò)的細(xì)胞。其他DNA操作和培養(yǎng)基配制按照《分子克隆》和《酵母遺傳學(xué)方法實(shí)驗(yàn)指南》進(jìn)行[9， 13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理方法對(duì)白念珠菌菌落PCR效果的影響

用傳統(tǒng)玻璃珠加酚/氯仿抽提法提取白念珠菌細(xì)胞基因組DNA做模板，我們可以PCR擴(kuò)出清晰、單一的900 bp DNA條帶（圖1泳道 1）。 與此相比，以未經(jīng)處理過(guò)的單菌落細(xì)胞為模板（圖1泳道2）和僅僅以玻璃珠破碎的細(xì)胞（圖1泳道4）為模板均只能擴(kuò)增出非常弱的目標(biāo)條帶，而以熱水煮沸5 min的細(xì)胞為模板能夠擴(kuò)增出明顯的目標(biāo)條帶（圖1泳道3）。用蝸牛酶處理過(guò)但不用沸水煮的細(xì)胞液為模板能夠擴(kuò)增出清晰的目標(biāo)條帶（圖1泳道5），而用蝸牛酶處理后再用沸水煮5 min的細(xì)胞液為模板的PCR擴(kuò)增出的目標(biāo)條帶濃度最高（圖1泳道6）。 這些結(jié)果表明，在這5種方法中，用蝸牛酶處理再經(jīng)沸水煮5 min后得到的單菌落細(xì)胞液（水煮酶解液）作為模板，通過(guò)PCR能得到的目的產(chǎn)物最佳。

2.2 水煮酶解液放置時(shí)間對(duì)PCR效果的影響

為檢測(cè)水煮酶解液儲(chǔ)藏條件對(duì)PCR效果的影響，把按1.2.1方案得到的RM1000細(xì)胞水煮酶解液在-20 ℃冰箱放置2個(gè)月。與新鮮處理過(guò)的RM1000細(xì)胞水煮酶解液相比較，放置了2個(gè)月的細(xì)胞水煮酶解液做模板經(jīng)菌落PCR也能得到清晰高濃度的目標(biāo)條帶（圖2泳道1和泳道2）。 這個(gè)結(jié)果表明水煮酶解液在-20 ℃冰箱放置2個(gè)月對(duì)PCR效果無(wú)影響。

2.3 菌落PCR在白念珠菌基因敲除工作中的應(yīng)用

我們實(shí)驗(yàn)室利用上述菌落PCR方案已經(jīng)成功篩選到白念珠菌IPF7530.2，CaTCO89和CaRCK2等多個(gè)基因的缺失突變體。圖3A是敲除IPF7530.2基因的策略，將構(gòu)建好的IPF7530.2基因敲除盒轉(zhuǎn)化到白念珠菌RM1000細(xì)胞中，在SD-URA平板上篩選URA+轉(zhuǎn)化子。URA+轉(zhuǎn)化子在5-FOA平板上彈出URA3標(biāo)記得到URA-轉(zhuǎn)化子。使用菌落PCR的方法對(duì)這些URA-轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果從48個(gè)URA-轉(zhuǎn)化子中成功篩選到3個(gè)IPF7530.2基因的雜合缺失突變體（IPF7530.2/ipf7530.2：：hisG）。 圖3B中的第11號(hào)轉(zhuǎn)化子（泳道11）就是其中一個(gè)。此外，還用同樣的方法分別鑒定了白念珠菌CaTCO89[4]和CaRCK2[14]基因的雜合和純合缺失突變體。

2.4 白念珠菌菌落PCR方法在基因克隆中的應(yīng)用

PCR模板的質(zhì)量經(jīng)常能夠影響到擴(kuò)增長(zhǎng)DNA片段的成功率，而據(jù)統(tǒng)計(jì)白念珠菌所有基因的平均長(zhǎng)度為2～3 Kb，所以白念珠菌基因克隆對(duì)模板質(zhì)量要求更高。為了驗(yàn)證菌落水煮酶解液是否滿足擴(kuò)增長(zhǎng)DNA片段的要求，用RM1000的水煮酶解液為模板，對(duì)全長(zhǎng)2.8 Kb的CaRCK2基因和3.4 Kb的CaTCO89基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，用水煮酶解液能夠成功擴(kuò)增這兩個(gè)基因的全長(zhǎng)，效果和傳統(tǒng)的以玻璃珠/酚/氯仿法提取的基因組DNA為模板得到的結(jié)果相似（圖4A和圖4B）。 這些結(jié)果證明，菌落PCR方法中的水煮酶解液也可以直接用于基因克隆。

3 討 論

白念珠菌是真核生物，有細(xì)胞壁，無(wú)法像大腸桿菌一樣使用未經(jīng)處理的菌落作為PCR模板。最常使用的白念珠菌模板為傳統(tǒng)的玻璃珠法提取的基因組DNA。筆者闡述了一種新型的白念珠菌菌落PCR方法：用蝸牛酶處理白念珠菌細(xì)胞，消化細(xì)胞壁，然后將酶解液放入100 ℃水中煮5 min使細(xì)胞破裂，用水煮酶解液作為模板進(jìn)行PCR，獲得了很好的PCR效果。試驗(yàn)證明，該方法可以成功應(yīng)用于白念珠菌基因型鑒定和長(zhǎng)達(dá)3.4 Kb的基因的克隆。該方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：⑴簡(jiǎn)捷快速，整個(gè)過(guò)程只需要2小時(shí)；⑵成本低，本方法的成本約為傳統(tǒng)玻璃珠加酚/氯仿法提取基因組DNA成本的1/50；⑶健康無(wú)污染，本方法避免了有機(jī)試劑酚/氯仿的使用，改用酶學(xué)方法處理細(xì)胞，即有利于工作人員的健康也不會(huì)造成環(huán)境污染，是一種非常理想的試驗(yàn)方法，可以廣泛應(yīng)用于白念珠菌的研究工作中。

參考文獻(xiàn)：

[1] 蔣伶活， 李西川， 智慧. 白念珠菌菌絲發(fā)育的遺傳調(diào)控[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志， 2006， 28（3）： 387-391.

[2] Whiteway M， Bachewich C. Morphogenesis in Candida albicans[J]. Annu Rev Microbiol， 2007， 61： 529-553.

[3] Fonzi W A， Irwin M Y. Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans[J]. Genetics， 1993， 134（3）： 717-728.

[4] Zheng C， Yan Z， Jiang L， et al. Identification and characterization of a functional Candida albicans homolog of the Saccharomyces cerevisiae TCO89 gene[J]. FEMS Yeast Res， 2007， 7（4）： 558-568.

[5] Wilson R B， Davis D， Mitchell A P. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions[J]. J Bacteriol， 1999， 181（6）： 1868-1874.

[6] Lee C M， Nantel A， Jiang L， et al. The serine/threonine protein phosphatase SIT4 modulates yeast-to-hypha morphogenesis and virulence in Candida albicans[J]. Mol Microbiol， 2004， 51（3）： 691-709.

[7] Wang J， Yan Z， Jiang L， et al. Expression of CaPTC7 is developmentally regulated during serum-induced morphogenesis in the human fungal pathogen Candida albicans[J]. Can J Microbiol， 2007， 53（2）： 237-244.

[8] Ward A C. Rapid analysis of yeast transformants using colony-PCR[J]. Biotechniques， 1992， 13（3）： 350.

[9] David C， Amberg， Daniel J. Methods in yeast genetics[M]. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2005.

[10] 葉玲， 劉建偉， 劉靜. 釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞的低溫保存及酵母菌落PCR-快速篩選鑒定[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2003， 30（6）： 956-959.

[11] Jiang L， Whiteway M， Shen S H. A novel type 2C protein phosphatase from the human fungal pathogen， Candida albicans[J]. FEBS Lett， 2001， 509（1）： 142-144.

[12] Jiang L， Lee C M， Shen S H. Functional characterization of the C. albicans homologue of secretion associated and Ras-related （Sar1） gene[J]. Yeast， 2002， 19（5）： 423-428.

[13] Joseph S， David W. Molecular cloning： A laboratory manual-3rd[M]. New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 2001.

[14] Li X， Huang X， Jiang L， et al. The MAP kinase-activated protein kinase Rck2p plays a role in rapamycin sensitivity in Saccharomycese cerevisiae and Candida albicans[J]. FEMS Yeast Res， 2008，8（5）：715-724.