潘冬瑞 李嘯 （等）

摘 要：用基因工程大腸桿菌 E.coli P84A/ MC1061生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶，此后，進一步進行了酵母浸出物FM888與酵母蛋白胨FP101的聯(lián)合調(diào)控作用研究。結(jié)果表明，用高溶解度酵母浸出物FM888替代原配方中的牛骨蛋白胨，可使E. coli P84A/ MC1061生長速率增大，發(fā)酵穩(wěn)定期的菌體濃度保持在較高水平，酶活提高了約2.4倍。當(dāng)補料培養(yǎng)基中的FM888與酵母蛋白胨FP101的比例為7∶3時，菌體濃度保持在較高水平（OD600≥120），酶活進一步提高約50%，大大提高了單罐產(chǎn)率。此研究可為其他酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)提供借鑒。

關(guān)鍵詞：鹵醇脫鹵酶；發(fā)酵控制；酵母浸出物；酵母蛋白胨

中圖分類號：Q939.9 文獻標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.07.002

Study on the Halohydrin Dehalogenases Produced by Recombinant E.coli P84A/ MC1061

PAN Dong-rui1， LI Xiao1，2， ZHANG Yao1， LI Jian-hua2， TAN Ya-li1

（ 1. College of Chemistry and Biology， China Three Gorges University， Yichang， Hubei 443003，China； 2. Angel Yeast Company Limited， Yichang， Hubei 443003， China）

Abstract： In this research， the recombinant E. coli P84A / MC1061 was utilized to produce halohydrin dehalogenases. With the ox bone peptone in the original formula replaced by the high solubility yeast extract yeast extract FM888， the growth rate of E. coli P84A/ MC1061 increased largely， and its dry cell weight maintained at a higher level in the stationary phase， whats more， the enzyme activity increased by 2.4 times. Then， integrating FM888 and yeast peptone FP101 into the regulation of the fed batch fermentation， the biomass maintained at a higher level （OD600≥120） and enzyme activity increased by about 50% when the proportion of FM888 and FP101 was 7∶3. This research could be used for reference by other industrial enzymatic production.

Key words： halohydrin dehalogenases； fermentation control； yeast extract； yeast peptone

E. coli P84A /MC1061中含有鹵醇脫鹵酶外源基因的質(zhì)粒，在添加L-阿拉伯糖誘導(dǎo)[1]后，可隨菌體生長而在胞內(nèi)表達鹵醇脫鹵酶。鹵醇脫鹵酶也叫鹵醇-鹵化氫裂解酶[2]，在催化環(huán)氧化物和鄰鹵醇之間的轉(zhuǎn)化反應(yīng)中，鹵醇脫鹵酶具有很高的立體選擇性，因而在手性藥物合成方面也有廣闊的應(yīng)用前景。序列同源性搜索以及二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，鹵醇脫鹵酶的結(jié)構(gòu)相似于短鏈脫氫酶/還原酶家族（SDRs），它的3個重要的催化殘基分別是：Tyr 145、Ser132和Arg149 [3] 。鹵醇脫鹵酶是目前世界范圍內(nèi)的一個全新的研究領(lǐng)域，目前的研究均僅限于鹵醇脫鹵酶基因的改造和優(yōu)化[4]，對于大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的影響因素及過程調(diào)控的研究甚少，且國內(nèi)外培養(yǎng)重組大腸桿菌生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶的研究中，至今未報道培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化。而利用大腸桿菌生產(chǎn)其他蛋白的培養(yǎng)基氮源使用也都僅限于動物蛋白胨（酪蛋白胨、胰蛋白胨等）[5]和植物蛋白胨（大豆蛋白胨等）[6]。

由于鹵醇脫鹵酶被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥中間體的生物催化合成[7]，故該酶制劑的安全性顯得尤為重要。本研究突破性地利用酵母蛋白胨發(fā)酵生產(chǎn)鹵醇脫鹵酶，舍棄常用的動植物類蛋白胨，可避免動植物蛋白胨可能帶來的致病性、風(fēng)俗禁忌問題以及過敏性問題。

本研究中將經(jīng)典培養(yǎng)基配方中的牛骨蛋白胨用試劑級酵母浸出物FM888替代，在搖瓶和50 L全自動控制反應(yīng)器中考察鹵醇脫鹵酶的表達情況。在此基礎(chǔ)上，在補料分批發(fā)酵中進一步研究酵母浸出物FM888與酵母蛋白胨FP101對鹵醇脫鹵酶發(fā)酵生產(chǎn)的聯(lián)合調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種 重組大腸桿菌E.coli P84A /MC1061，由安琪酵母股份有限公司菌種室提供。

1.1.2 試 劑 L-阿拉伯糖（L（+）-Arabinose），購于Sigma公司。酵母浸出物FM888和酵母蛋白胨FP101由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)。其他試劑均為分析純AR。

1.1.3 種子培養(yǎng)基[8] 斜面培養(yǎng)基：甘油8 g·L-1，酵母浸出物（FM818）25 g·L-1， NaCl 6 g·L-1， KH2PO4 4.25 g·L-1，K2HPO4 4.25 g·L-1，Na2HPO4 8.5 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，瓊脂粉15 g·L-1。

液體種子培養(yǎng)基：甘油 8 g·L-1，蛋白胨 10 g·L-1，F(xiàn)M818 15 g·L-1，氯化鈉 6 g·L-1，磷酸氫二鈉 8.5 g·L-1，磷酸氫二鉀 4.25 g·L-1，磷酸二氫鉀 4.25 g·L-1，硫酸鎂 1 g·L-1。調(diào)pH值為7.1。

1.1.4 誘導(dǎo)劑溶液 濃度為 0.05 g·mL-1 L-阿拉伯糖溶液。

1.2 主要測定方法

1.2.1 種子培養(yǎng)方法 搖瓶種子培養(yǎng)：將斜面菌樣接入裝有25 mL液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，在30 ℃和200 r·min-1搖床上培養(yǎng)20 h。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)及誘導(dǎo)產(chǎn)酶 搖瓶發(fā)酵：將種子液接入發(fā)酵搖瓶后，在30 ℃，200 r·min-1條件下培養(yǎng)2 h向發(fā)酵液中加入0.5 mL L-阿拉伯糖溶液，培養(yǎng)時間為24 h。

50 L罐發(fā)酵：接種量2%；空氣流量比為1.1 vvm；攪拌轉(zhuǎn)速200～500 r·min-1；培養(yǎng)溫度30 ℃；罐壓0.04 MPa；采用間歇式補料。培養(yǎng)時間為24 h。

1.2.3 菌體量測定 方法參見參考文獻[9]。

1.2.4 鹵醇脫鹵酶酶活力測定 參考文獻[10]。

1.2.5 氨基氮測定 參考文獻[11]。

1.2.6 氨基酸測定 參考文獻[12]。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 搖瓶及50 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵試驗方案 發(fā)酵培養(yǎng)基配方中常加入一定濃度的蛋白胨，本研究中的對照組，即為經(jīng)典培養(yǎng)基方案（1組）（表1）。而試驗組是將1組中的牛骨蛋白胨全部用酵母浸出物FM888取代，即2組，再進行搖瓶發(fā)酵和50 L罐動態(tài)控制發(fā)酵，比較兩種方案下對鹵醇脫鹵酶表達的影響。

1.3.2 酵母浸出物FM888與酵母蛋白胨FP101的聯(lián)合調(diào)控試驗方案 在動態(tài)考察酵母浸出物含量對鹵醇脫鹵酶表達的影響后，為進一步深入研究酵母浸出物FM888和酵母蛋白胨FP101調(diào)控配比，接著進行50 L補料發(fā)酵。通過改變菌種原始培養(yǎng)基中N源的比例，做對比研究，試驗配比見表2。試驗數(shù)據(jù)對比，驗證補料中添加適量酵母蛋白胨對重組菌生長以及產(chǎn)酶的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶發(fā)酵試驗

試驗結(jié)果表明（表3），第2組中以等質(zhì)量的酵母浸出物取代牛骨蛋白胨后，pH值回升快，OD600明顯增大，說明E.coli P84A /MC1061能快速利用培養(yǎng)基中的碳氮源，菌體生長速率加快鹵醇脫鹵酶活力有一定幅度提高，此外，也說明鹵醇脫鹵酶的表達量與生物量的積累存在正相關(guān)關(guān)系。

2.2 50 L罐分批發(fā)酵試驗

50 L罐分批發(fā)酵過程酶活變化趨勢如圖1所示。由圖知，1組酶活在14 h達最大值75 680 U·mL-1，發(fā)酵過程中酶活呈先上升后下降的趨勢；2組酶活在24 h達最大值180 621 U·mL-1，發(fā)酵過程中酶活呈持續(xù)上升趨勢，比1組的酶活提高了2.4倍。這說明將培養(yǎng)基中的牛骨蛋白胨全部替換成酵母浸出物FM888可明顯提高鹵醇脫鹵酶的表達量。

2.3 酵母浸出物FM888與酵母蛋白胨FP101聯(lián)合調(diào)控的結(jié)果

按照表2中的4組方案設(shè)計在50 L發(fā)酵罐中進行補料發(fā)酵試驗，測定結(jié)果如圖2和3所示。4個設(shè)計組中，其發(fā)酵過程非常相似，0～2 h為延滯期，2～20 h為對數(shù)生長期，20～30 h為穩(wěn)定期。穩(wěn)定期的生物量相差不大，最小值100，最大值120。但酶活力有著明顯的差異，最大值比最小值約高出10萬U·mL-1。

當(dāng)采用第1組配方后，當(dāng)初始培養(yǎng)基和補料培養(yǎng)基中氮源均使用FM888時，生物量的積累相對較小，酶活值較低。

在第2組配方中，當(dāng)把底料中以30%酵母蛋白胨FP101等質(zhì)量替換FM888，補料氮源全采用FM888時，前期菌體量生長依舊相對緩慢，但后期菌體量明顯加速上升，酶活力相對有較大提升。

第3組配方中，當(dāng)發(fā)酵底料氮源全采用FM888不變，把補料氮源改為以30%酵母蛋白胨等質(zhì)量替換FM888時，發(fā)酵前期菌體量雖有較快生長，但后期菌體量和酶活力均呈現(xiàn)出后勁不足，發(fā)酵后期上升幅度較小。

在第4組配方中，當(dāng)發(fā)酵底料和補料N源均以30%酵母蛋白胨等質(zhì)量替換酵母浸出物FM888時，可以得出，發(fā)酵周期的后期比生長速率較小，但表現(xiàn)出較大的發(fā)酵后勁，酶活力有著明顯的提高，在整個發(fā)酵過程中，酶活力一直有著較大的增幅。與第1組發(fā)酵結(jié)果相比，酶活提高約50%。

2.4 酵母浸出物FM888、牛骨蛋白胨和酵母蛋白胨FP101氨基酸含量分析

為探究各配比設(shè)計組出現(xiàn)不同趨勢的原因，用氨基酸分析儀對酵母浸出物FM888、牛骨蛋白胨和酵母蛋白胨FP101進行氨基酸含量測定，游離氨基酸和水解氨基酸含量結(jié)果分別如圖4、5所示。

由圖4、5可知，除了精氨酸（L-Arg）外，牛骨蛋白胨的各種游離氨基酸的含量大大低于FM888的。除了甘氨酸（L-Gly）、脯氨酸（L-Pro）、丙氨酸（L-Ala）和精氨酸（L-Arg）外，其他各水解氨基酸的含量均低于FM888的。

除精氨酸（L-Arg）、丙氨酸（L-Ala）外，酵母蛋白胨FP101游離氨基酸的含量在FM888和牛骨蛋白胨之間。就水解氨基酸而言，除甘氨酸（L-Gly）、脯氨酸（L-Pro）和精氨酸（L-Arg）含量低于牛骨蛋白胨，纈氨酸（L-Val）、異亮氨酸（Ile）和精氨酸（L-Arg）含量低于FM888外，其余水解氨基酸的含量均高于牛骨蛋白胨和FM888。

以上說明，牛骨蛋白胨大分子肽類含量高，而小分子肽類和游離氨基酸含量較低，微生物對其利用速率低，生物量積累速率低；FM888的游離氨基酸含量高，而肽類含量較低，微生物對其利用快，但持續(xù)增效作用不夠；FP101的肽類總含量和游離氨基酸總含量介于FM888與牛骨蛋白胨之間。當(dāng)FM888與FP101以一定比例混合使用時，可將游離氨基酸和肽類含量調(diào)整到合適水平，既能滿足菌體快速生長的營養(yǎng)需求，又可促進鹵醇脫鹵酶的持續(xù)高效表達，增強發(fā)酵后勁。

3 結(jié) 論

將經(jīng)典的鹵醇脫鹵酶發(fā)酵培養(yǎng)基配方中的牛骨蛋白胨用試劑級酵母浸出物FM888替代時，由于酵母浸出物含有較多的游離氨基酸，導(dǎo)致生物量的快速積累，鹵醇脫鹵酶的表達量較高，后者是前者的2.4倍。將酵母浸出物FM888與酵母蛋白胨FP101以7∶3的比例加入初始培養(yǎng)基及補料培養(yǎng)基中，游離氨基酸和肽類含量被調(diào)整到合適水平，酶活在原來基礎(chǔ)上提高50%。

此外，由于FM888和FP101的原料來源于面包酵母，無轉(zhuǎn)基因爭議、無致病性、無過敏原、無風(fēng)俗禁忌等問題，如果將它們廣泛的應(yīng)用于食品及藥品的發(fā)酵生產(chǎn)，一方面可保證產(chǎn)品的安全性，另一方面有助于用戶通過KOSHER、HALAL等國際認證， 以適應(yīng)廣大消費者對食品、藥品安全性日益提高的要求。此研究可為酵母蛋白胨替代傳統(tǒng)的動植物蛋白胨的發(fā)酵生產(chǎn)提供借鑒。

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