張瑤 李嘯 潘冬瑞

摘 要：通過單因素試驗(yàn)篩選出植物乳桿菌的最適碳源、氮源以及各緩沖鹽、無機(jī)鹽等物質(zhì)的種類及優(yōu)化濃度。再通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出顯著影響因子。然后用最陡爬坡試驗(yàn)逼近關(guān)鍵因素的最大響應(yīng)區(qū)域。最后在此基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法對培養(yǎng)基組分進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，得出其最佳濃度。結(jié)果表明，優(yōu)化得到3種顯著因子糖蜜、MgSO4、吐溫-80通過響應(yīng)面優(yōu)化后的結(jié)果分別為23.79%（v/v），0.16%（w/v），1.35%（w/v）。采用優(yōu)化培養(yǎng)基后活菌數(shù)可達(dá)到4.45×109cfu·mL-1，較在MRS中培養(yǎng)的活菌數(shù)提高12倍左右。

關(guān)鍵詞：培養(yǎng)基優(yōu)化；高密度培養(yǎng)；響應(yīng)面設(shè)計(jì)；植物乳桿菌；糖蜜

中圖分類號：S816.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.07.001

Media Optimization of Culturing Lactobacillus plantarum by Box-Benhnken Design

ZHANG Yao1， LI Xiao1，2， PAN Dong-rui1

（1.College of Chemistry and Biology，China Three Gorges University， Yichang， Hubei 443003，China；2.Angel Yeast Company Limited，Yichang， Hubei 443003， China ）

Abstract： Lactobacillus plantarum optimum carbon source， nitrogen source and various buffer salts， inorganic salts and other types of substances and preliminary optimized concentration was screened by single factor experiment. Significantly impact factor by Plackett-Burman experimental design was obtained and approached largest response area of the key factor by steepest ascent experiment.On this basis， best optimum concentration of the medium components was obtained by using the Box-Behnken design. The results showed optimal concentration of molasses， MgSO4， Tween-80 was 23.79% （v/v）， 0.16% （w/v）， 1.35% （w/v） respectively. The viable cell count reached 4.45×109cfu·mL-1， which was about 12 times larger than cultured in MRS medium.

Key words： medium optimization； high-density cultivation； response surface design； Lactobacillus plantarum； molasses

植物乳桿菌是乳酸菌的一種，與人類的生活關(guān)系非常密切，常見于奶油、肉類及許多蔬菜發(fā)酵制品中，能通過胃并定植于腸道發(fā)揮有益作用[1]。植物乳桿菌可以將食品原料中的糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗幔?同時產(chǎn)生抗菌肽、胞外多糖和其他代謝產(chǎn)物，供人體吸收利用[2]。

目前在植物乳桿菌培養(yǎng)基優(yōu)化方面，國內(nèi)的研究中大多采用葡萄糖、蔗糖等作為碳源，而葡萄糖、蔗糖的價(jià)格較高，增大了生產(chǎn)的成本。另外，在國內(nèi)外的諸多研究中培養(yǎng)基大多使用動植物蛋白胨作為氮源，由于動植物蛋白胨對人體可能帶來致病性、敏感性等一系列安全問題，經(jīng)此發(fā)酵的植物乳桿菌運(yùn)用到食品和醫(yī)療保健等方面就具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性。所以，尋求低成本且在安全性上有保證的植物乳桿菌培養(yǎng)基勢在必行。

本研究旨在選擇低成本、安全性高、能顯著促進(jìn)菌體生長的培養(yǎng)基，為工業(yè)生產(chǎn)提供參考依據(jù)。在充分考慮培養(yǎng)基成分選擇的前提下，通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)、Box-Behnken 設(shè)計(jì)等對植物乳桿菌培養(yǎng)基成分進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，最終顯著提升了植物乳桿菌的活菌數(shù)。

1 材料和方法

1.1 菌 種

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），由安琪酵母股份有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基[3]：葡萄糖2%，牛肉膏 1%，蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，檸檬酸三銨0.1%，磷酸酸氫二鉀 0.2%，醋酸鈉 0.5%，硫酸鎂 0.2%，吐溫-80 0.058%，硫酸錳 0.025%，pH 值6.2。

1.2.2 活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基 葡萄糖2%，牛肉膏 1%，蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，檸檬酸三銨0.1%，磷酸氫二鉀 0.2%，醋酸鈉 0.5%，硫酸鎂 0.2%，吐溫-80 0.058%，硫酸錳 0.025%，瓊脂粉2%，pH值 6.2。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 菌種的活化 將甘油管保存的菌種取1 mL，放入裝有50 mL液體MRS培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，瓶口加棉塞并用保鮮膜密封，于180 rpm搖床在30 ℃的條件下培養(yǎng)13 h。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的種子液以4%的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，瓶口加棉塞并用保鮮膜密封，于180 r·min-1搖床在30 ℃的條件下培養(yǎng)15 h。

1.4 檢測方法

1.4.1 活菌計(jì)數(shù) 方法見參考文獻(xiàn)[5]。

1.4.2 OD值測定 發(fā)酵液用蒸餾水稀釋適當(dāng)倍數(shù)并震蕩混勻后，用可見分光光度計(jì)測定600 nm處的吸收值（OD600）。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

1.5.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)[6] 通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)，對經(jīng)過單因素試驗(yàn)挑選出的幾種物質(zhì)（糖蜜、YE、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80）進(jìn)一步優(yōu)化，選出對植物乳桿菌生長的最顯著因子。Plackett-Burman設(shè)計(jì)采用5因子2水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個因素取高（+1）低（-1）兩個水平（以單因素試驗(yàn)得出的最佳濃度作為參考），其中響應(yīng)值為活菌數(shù)。通過對效應(yīng)值的計(jì)算，同時進(jìn)行t檢驗(yàn)，置信度高的因子為最顯著因子。

1.5.2 最陡爬坡試驗(yàn) 響應(yīng)面擬合方程只有在考察的整個領(lǐng)域里才能充分?jǐn)M合近似的真實(shí)情形。最陡爬坡試驗(yàn)?zāi)芨鶕?jù)各因素效應(yīng)值的大小，經(jīng)濟(jì)、快速地逼近最佳值區(qū)域。根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的結(jié)果，選擇對植物乳桿菌增殖影響顯著的因子（糖蜜、硫酸鎂、吐溫-80），根據(jù)t值的大小確定合適的步長和正確的方向，快速逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.5.3 Box-Behnken 設(shè)計(jì)[7] 根據(jù) Box- Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)一步進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，設(shè)計(jì)17個試驗(yàn)點(diǎn)，17個試驗(yàn)點(diǎn)可以分為兩類，其一是析因點(diǎn)，自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，共有12個析因點(diǎn)；其二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

通過單因素試驗(yàn)對植物乳桿菌培養(yǎng)基成分進(jìn)行篩選，初步優(yōu)化的配方如下：糖蜜（v/v）28%、YE（w/v） 14%、硫酸鎂（w/v） 0.2%、硫酸錳（w/v） 0.04%、吐溫-80 （w/v） 0.7%、磷酸氫二鉀（w/v） 0.8%、檸檬酸三銨（w/v） 0.4% ，選擇其中顯著的5種物質(zhì)糖蜜、YE、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80 進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 Plackett-Burman設(shè)計(jì)

對糖蜜、YE、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫-80 5種物質(zhì)進(jìn)行Plackett-Burman設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)結(jié)果和分析如表1、表2所示。

按表1進(jìn)行Plackett-Burman 試驗(yàn)，用12種不同質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行植物乳桿菌培養(yǎng)。經(jīng)過方差分析，列出了Plackett-Burman試驗(yàn)各因素參數(shù)的分析結(jié)果，由表2可見，糖蜜對植物乳桿菌活菌數(shù)的影響非常顯著（P=0.000 7），吐溫-80（P =0.010 5）和硫酸鎂（P=0.035 1）對植物乳桿菌活菌數(shù)影響顯著，5種成分的顯著性依次為：糖蜜>吐溫-80>硫酸鎂>硫酸錳>YE。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.912 5，相關(guān)性較好。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

由Plackett-Burman設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果，確定主要因素的最陡爬坡路徑，其中糖蜜、硫酸鎂為負(fù)效應(yīng)，應(yīng)該減少；吐溫-80為正效應(yīng)，應(yīng)該增加。其他物質(zhì)取單因素試驗(yàn)得到的最優(yōu)化的濃度。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

由表3可見，第2組所得到的活菌數(shù)最高，故以糖蜜（v/v）24%、硫酸鎂（w/v）0.16%、吐溫-80（w/v）0.8%為Box-Behnken設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)，進(jìn)行進(jìn)一步的Box-Behnken設(shè)計(jì)。

2.4 Box-Behnken 設(shè)計(jì)

Box-Behnken 設(shè)計(jì)的結(jié)果和方差分析如表4、表5所示。

以試驗(yàn)結(jié)果表4中的活菌數(shù)作為響應(yīng)量，其二階多項(xiàng)式回歸方程常數(shù)項(xiàng)和系數(shù)的分析如表5所示。然后根據(jù)這些新的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，可以得到回歸方程：

活菌數(shù)（cfu·mL-1） =41.46-1.17A-1.25 B+3.25C-0.83AB+0.32AC-0.18BC-7.24A2-8.39B2-0.89C2

經(jīng)方差分析結(jié)果表明，該方程的決定系數(shù)為R2=0.984 0，Adj R2=0.963 4，說明該模型預(yù)測值與實(shí)測值之間擬合度好，能解釋96.34%的響應(yīng)值的變化，只有總變異的3.66%不能用此模型解釋，說明該方程擬合度好，模型精度高。

通過Design Expert 8.0.6對表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合得到二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線（圖1～圖3）。

由圖1、圖2、圖3可知，3種成分的交互作用明顯。此回歸模型得出Box-Benhnken 設(shè)計(jì)的最優(yōu)結(jié)果為糖蜜23.7%（v/v）、硫酸鎂0.16%（w/v）、吐溫-80 1.35%（w/v），在此優(yōu)化條件下的活菌數(shù)為4.45×109cfu·mL-1。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢測模型優(yōu)化結(jié)果的準(zhǔn)確性，按優(yōu)化的結(jié)果配制培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，設(shè)置平行組，3次試驗(yàn)結(jié)果的平均活菌數(shù)為4.67×109cfu·mL-1，和模型預(yù)測值接近，驗(yàn)證了此模型的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論與討論

通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定影響植物乳桿菌活菌數(shù)的3個顯著因子糖蜜、硫酸鎂、吐溫-80。然后用最陡爬坡試驗(yàn)對顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，從而確定影響植物乳桿菌活菌數(shù)的最佳值區(qū)域。通過Box-Behnken設(shè)計(jì)確定培養(yǎng)植物乳桿菌優(yōu)化培養(yǎng)基的3個顯著因素的濃度分別為糖蜜23.7%（v/v）、硫酸鎂0.16%（w/v）、吐溫-80 1.35%（w/v）。在此優(yōu)化條件下的活菌數(shù)為4.45×109cfu·mL-1，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中用優(yōu)化后的培養(yǎng)基對植物乳桿菌培養(yǎng)，得到的活菌數(shù)為4.67×109cfu·mL-1，說明了模型的可靠性。

優(yōu)化后得到的活菌數(shù)相對于優(yōu)化前在MRS中培養(yǎng)得到的植物乳桿菌活菌數(shù)3.87×108cfu·mL-1，提高了12倍左右。

用響應(yīng)面法（RSM）建立了植物乳桿菌高密度培養(yǎng)工藝的模型。從模型的曲面圖就能獲得工藝參數(shù)大概的取值范圍，有利于工藝參數(shù)的選擇和工藝條件的優(yōu)化[7]。優(yōu)化后較優(yōu)化前活菌數(shù)目提高了12倍，說明響應(yīng)面法的試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法能快速、有效地對影響植物乳桿菌發(fā)酵的培養(yǎng)基成分實(shí)現(xiàn)優(yōu)化，得到最佳配比。

工業(yè)生產(chǎn)需要考慮生產(chǎn)成本問題，生產(chǎn)廢料的再利用和提高發(fā)酵工藝是現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)的必經(jīng)之路。糖蜜是制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，價(jià)格相對而言比較低廉[8]，但其含有豐富的營養(yǎng)成份，除了含有大量的發(fā)酵糖以外，還含有少量的蛋白質(zhì)、氨基酸和礦物質(zhì)[9]，能夠很好促進(jìn)植物乳桿菌的生長。

本研究選擇食糖加工過程中的副產(chǎn)品蔗糖糖蜜作為植物乳桿菌培養(yǎng)基的碳源，這是因?yàn)檎崽翘敲鄄粌H成本較低，而且含有豐富的發(fā)酵糖和少量的蛋白質(zhì)、氨基酸，其中天門冬氨酸、谷氨酸含量較多，除此之外，礦物質(zhì)的含量也較高，如鉀、氯、鈉、鎂等。培養(yǎng)基的氮源選擇酵母浸出物FM888，酵母浸出物是以蛋白質(zhì)含量豐富的酵母為原料，采用生物技術(shù)將酵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等進(jìn)行降解而成，含有豐富的多肽和氨基酸[10]，作為植物乳桿菌培養(yǎng)基的氮源非常安全，不會對人體造成致病性及一些過敏現(xiàn)象等。所以采用糖蜜作為培養(yǎng)基成分不但可以解決高成本問題，而且在營養(yǎng)成分方面表現(xiàn)出“多面手”的角色，所以選擇糖蜜來發(fā)酵可以起到一舉多得的效果。

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