摘要：利用超薄等電聚焦電泳技術(shù)對8個不同的大白菜品種種子蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，大白菜種子鹽溶蛋白具有較高的多態(tài)性，在所測試的8個品種中共發(fā)現(xiàn)9條蛋白質(zhì)多態(tài)性條帶，依這9條蛋白質(zhì)多態(tài)性條帶可將8個品種區(qū)別開來，與大田種植鑒定結(jié)果一致。因此，種子蛋白質(zhì)超薄等電聚焦電泳技術(shù)可應(yīng)用于大白菜品種鑒定。

關(guān)鍵詞：大白菜；鹽溶蛋白；超薄等電聚焦電泳；品種鑒定

中圖分類號：S634.103.7；Q503 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2013）08-0039-03

大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis） 適應(yīng)范圍廣，栽培面積大，是我國第一大蔬菜作物_[1]。品種改良是實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素，隨著生產(chǎn)力的發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，大白菜育種日益受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。為了在較短時(shí)間內(nèi)培育出高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)品系，部分品種采用了共同的親本或自交系，客觀上縮小了品種間的遺傳差異性。近年來，大白菜品種日漸增多，同時(shí)，在生產(chǎn)上假冒偽劣種子事件時(shí)常發(fā)生。因此，鑒定品種真實(shí)性對大白菜新品種登記和品種知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)等顯得極為重要。

目前，大白菜品種鑒定以大田種植鑒定為主_[2]。盡管大田種植鑒定的結(jié)果最準(zhǔn)確，但其所需時(shí)間比較長（通常需要一個生長季節(jié)），且要消耗大量的人力和物力，而且很多性狀受栽培措施及環(huán)境因素的影響_[3]。為此，迫切需要一種準(zhǔn)確、快速的大白菜品種鑒定方法。

電泳技術(shù)在種子真實(shí)性檢測中被廣泛應(yīng)用，根據(jù)電泳對象的不同可分為同功酶電泳和蛋白質(zhì)電泳。同功酶電泳技術(shù)曾被應(yīng)用于大白菜品種鑒定_[4～7]。利用同工酶鑒別品種及種子純度存在的問題是： 同工酶存在時(shí)期特異性和器官特異性，多數(shù)作物種子需發(fā)芽，由于種子發(fā)芽速度不同造成個體間差異，容易引起誤差，并且同工酶的提取、電泳等多數(shù)需要在低溫下進(jìn)行，增加了電泳操作和電泳技術(shù)推廣的難度。由于同工酶分析存在上述不利因素，在應(yīng)用中受到限制_[7]。普通聚丙烯酰胺凝膠電泳也應(yīng)用于品種鑒定，結(jié)果表明蛋白質(zhì)多樣性位點(diǎn)的變化不足以區(qū)分所有的品種_[5，8]。分子標(biāo)記作為一種新的基于DNA水平多態(tài)性的遺傳標(biāo)記，具有許多優(yōu)勢。分子標(biāo)記技術(shù)越來越多地應(yīng)用于大白菜的品種鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建_[7～13]。但分子標(biāo)記費(fèi)用高，操作復(fù)雜，使它的應(yīng)用受到了限制。

種子蛋白質(zhì)超薄等電聚焦電泳 （Ultrathin-layer Isoelectric Focusing， 簡稱為UTLIEF）是一種簡便、快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，該法在番茄_[14]、水稻_[15]、玉米_[16]、南瓜_[17]等品種鑒定上取得較好結(jié)果。目前還未見到利用該技術(shù)鑒定大白菜品種的報(bào)道。 本研究首次利用UTLIEF技術(shù)，對當(dāng)前生產(chǎn)上栽培面積較大的部分大白菜品種進(jìn)行鑒定，辨別真?zhèn)?，為這些品種的管理提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

所用大白菜品種為87-114、神州5號、強(qiáng)者、強(qiáng)勢、菊錦、春月黃、冠春、CR黃心秋，均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院程險(xiǎn)峰老師提供。

1.2種子蛋白質(zhì)的提取

取上述不同品種單粒種子放在濾紙上，用研槌逐粒壓碎，去殼，置于離心管中，按30∶1（V/W）比例加入蛋白提取液。常溫下提取1 h后，10 000 r/min離心10 min。上清液20 μl用于電泳點(diǎn)樣。本研究采用3種不同提取液：去離子水、0.01%（W/V）NaCl溶液和30%（V/V）2-氯乙醇。

1.3超薄等電聚焦電泳

按國際種子檢驗(yàn)規(guī)程_[18]進(jìn)行。本研究采用4種不同pH范圍的兩性電解質(zhì)（3.0～9.5，4.0～7.0，5.0～8.0，6.0～9.0）。

1.4大田種植鑒定

大田種植鑒定在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)萊陽試驗(yàn)站進(jìn)行。在苗期、蓮座期、結(jié)球期，根據(jù)葉片顏色、厚薄、形狀；在收獲前， 根據(jù)葉色、葉球抱合方式、球的形態(tài)等特征特性鑒定不同品種。

2結(jié)果與分析

2.1超薄等電聚焦電泳鑒定

為了找到合適的蛋白質(zhì)提取液和合適的pH范圍，本研究利用3種不同的提取液結(jié)合4種不同pH范圍的兩性電解質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用0.01%（W/V）NaCl溶液和pH范圍為5.0～8.0的兩性電解質(zhì)試驗(yàn)時(shí)，得到的蛋白質(zhì)圖譜更清晰，多態(tài)性條帶更多（圖1）。其中靠近正極的染色較深，多態(tài)性低，而靠近負(fù)極的染色淺，多態(tài)性高，8個大白菜品種在9個位點(diǎn)上出現(xiàn)了多態(tài)性。

不同大白菜品種種子所含的多態(tài)性蛋白條帶不同（表1），根據(jù)所含蛋白質(zhì)多態(tài)性條帶差異，很容易將這8個品種區(qū)分開。

3討論與結(jié)論

大白菜品種類型多樣，為了對商品種子進(jìn)行品種鑒別、新品種登記測試以及種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，非常需要一種高效、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)實(shí)用的品種鑒別技術(shù)。

蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，其位點(diǎn)差異代表了植物生物學(xué)特性的多態(tài)性。種子蛋白質(zhì)電泳技術(shù)不需發(fā)芽，省時(shí)、省力，試驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定，不易受外界條件影響，已成為主要農(nóng)作物種子純度檢測的主要手段。超薄等電聚焦電泳技術(shù)分辨率高_[19]，和普通的聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，能檢測出更多的總蛋白和多態(tài)性蛋白條帶_[14～17]。

本研究結(jié)果表明，超薄等電聚焦電泳能在不同的大白菜品種種子蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)較多的多態(tài)性條帶，從而將不同的品種區(qū)分開來，與大田種植鑒定結(jié)果一致。因此，種子蛋白質(zhì)超薄等電聚焦電泳是一種可靠、簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的大白菜品種鑒定技術(shù)。

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