權(quán)燕敏　肖海峰　陳宗禮

摘要：以繼代培養(yǎng)20代后經(jīng)生根培養(yǎng)基生根的京棗試管苗為試驗(yàn)材料，用常規(guī)染色體壓片和顯微觀察相結(jié)合的方法對(duì)根尖進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，結(jié)果顯示，京棗試管苗的染色體數(shù)目2n=24條的占85%，說(shuō)明經(jīng)繼代培養(yǎng)的京棗試管苗仍保持遺傳穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：棗；試管苗；染色體；核型

中圖分類號(hào)：S665.1：Q343.2+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2013）08-0036-03

植物組織培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于珍貴種質(zhì)資源的離體保存、優(yōu)良體細(xì)胞無(wú)性系變異材料的創(chuàng)建以及物種庫(kù)的建立和保存，因而研究組培試管苗能否穩(wěn)定遺傳具有很大的應(yīng)用價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于山葡萄_[1]、芥藍(lán)_[2]、百合等_[3～6]品種組培苗遺傳穩(wěn)定性的報(bào)道有許多，但關(guān)于棗樹組培苗遺傳穩(wěn)定性的研究較少_[7～10]。本試驗(yàn)旨在通過(guò)探討京棗組培苗的遺傳穩(wěn)定性，為棗樹組培苗的快繁、生產(chǎn)和推廣提供理論依據(jù)與指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與試劑

供試材料為京棗（Zizyphus jujuba Mill. Jingzao）試管苗，由陜西省延安大學(xué)紅棗繁育工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，取繼代培養(yǎng)20代后經(jīng)生根培養(yǎng)基生根的京棗試管苗根尖用于染色體觀察。

用于染色體制片的主要試劑有飽和對(duì)二氯苯溶液、改良苯酚品紅染液、0.075 mol/L氯化鉀溶液。

1.2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

試管棗苗生根培養(yǎng)基（S15）：1/2 MS+1.0 mg/L IBA +0.02 mg/L NAA +20%蔗糖+0.55%瓊脂。

培養(yǎng)條件：溫度為24～27℃，相對(duì)濕度為60%～65%，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx。

1.3材料準(zhǔn)備與取樣

根據(jù)試管苗的長(zhǎng)度，將繼代培養(yǎng)的京棗試管苗剪成2～4 cm的莖段，轉(zhuǎn)接到S15生根培養(yǎng)基，接種后第3天統(tǒng)計(jì)生根的試管苗數(shù)，以后每隔5天統(tǒng)計(jì)生根數(shù)。

取樣：取剛長(zhǎng)出1.5～2.0 cm長(zhǎng)的根，此時(shí)根分生能力最旺盛，最適合于染色體觀察。取樣時(shí)間：上午9時(shí)。

1.4材料處理

（1）預(yù)處理：將所取材料浸入飽和對(duì)二氯苯溶液，振蕩培養(yǎng)箱常溫振蕩4 h。

（2）固定：預(yù)處理后，用蒸餾水將材料清洗3次，每次3～5 min，再用現(xiàn)配的Carnoys固定液（無(wú)水酒精∶冰醋酸=3∶1）常溫下固定12 h。

（3）前低滲：固定后的材料用蒸餾水清洗3次，每次3～5 min，然后用濾紙將材料上的水分吸干，放入0.075 mol/L KCl溶液中30 min，15 min換液一次。

（4）解離：將材料置于1 mol/L HCl中60℃恒溫水浴加熱，根尖解離時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般為10 min，解離充分的標(biāo)志是組織間有大量氣泡，解離后的材料用鑷子夾出迅速放入1 mol/L冷鹽酸中浸泡30 s。

（5）后低滲：經(jīng)冷鹽酸浸泡后，蒸餾水清洗3次，每次3～5 min，放入0.075 mol/L KCl溶液中60 min，30 min換一次溶液。

（6）染色：用改良苯酚品紅染液染色24 h。

（7）壓片：選取材料分生最旺盛的部分（一般為未展開葉片的葉原基、莖尖的分生組織），用解剖針取肉眼剛好能看清的一小塊組織，放在潔凈的載玻片上，蓋上蓋玻片（中間不能有氣泡）。

（8）脫水：將染色壓制好的制片，倒放在盛有45%醋酸+95%酒精（V∶V=1∶1）的培養(yǎng)皿中，使載玻片稍傾斜（一邊墊上一玻棒），經(jīng)5～10 min，可見(jiàn)蓋玻片從載玻片上脫離，用吸水紙吸去載玻片和蓋玻片邊上多余的酸液，再依次經(jīng)過(guò)以下濃度梯度的酒精：20%、30%、50%、70%、85%、95%、100%，每個(gè)濃度停留30 min。

（9）透明：經(jīng)過(guò)以下步驟：1/3二甲苯﹢2/3純酒精 →1/2二甲苯﹢1/2純酒精→2/3二甲苯+1/3純酒精→純二甲苯，逐步進(jìn)行，每步3 min，使材料既除去酒精，又不收縮變形。

（10）封藏：將玻片從二甲苯中取出，在標(biāo)本上滴光學(xué)樹膠（樹膠的量以蓋上蓋玻片后剛好鋪滿為合適），然后蓋上一同處理的蓋玻片（中間沒(méi)有氣泡）。將封好的玻片標(biāo)本在恒溫培養(yǎng)箱中40℃烘烤至干燥，貼上標(biāo)簽，即可永久保存。

（11）鏡檢：40×10倍光學(xué)顯微鏡觀察約60個(gè)比較清晰的分裂相細(xì)胞，鑒定其中的染色體數(shù)目，進(jìn)行OLYMPUS顯微照相。

2結(jié)果與分析

對(duì)60個(gè)根尖細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)分析，從表1可以看出，京棗根尖染色體數(shù)目2n=24的占85%，百分?jǐn)?shù)檢驗(yàn)差異極顯著，說(shuō)明京棗繼代培養(yǎng)20代的組培苗染色體數(shù)目未發(fā)生變化，即表現(xiàn)穩(wěn)定遺傳。染色體圖見(jiàn)圖1。

3討論

3.1染色體制片方法的探討

3.1.1解離時(shí)間和溫度的把握 棗樹細(xì)胞的細(xì)胞壁比較厚，解離時(shí)間不能太短，時(shí)間太短，會(huì)使解離不徹底，染色效果不好，甚至染不上色；但也不能太長(zhǎng)，否則酸會(huì)水解染色體中的蛋白質(zhì)，使染色體受損，難以得出正確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，在解離時(shí)，要注意隨時(shí)觀察組織的解離狀況，有大量氣泡即說(shuō)明解離充分，一般為10 min。解離溫度要控制在60℃，溫度過(guò)高會(huì)使酸解離速度加快，導(dǎo)致解離的進(jìn)程不能被很好的控制。因此，本試驗(yàn)采用兩支溫度計(jì)，一支測(cè)解離直管內(nèi)的實(shí)際溫度，一支測(cè)定管外水溫，從而準(zhǔn)確控制解離溫度。

3.1.2低滲時(shí)間酸濃度的高低對(duì)染色體的皺縮程度有一定影響，過(guò)高會(huì)使染色體高度皺縮，從而影響染色體觀察。低滲可以通過(guò)離子互換降低組織間的酸濃度，使染色體膨脹，在壓片后保持清晰的形態(tài)，以利于觀察，如果低滲時(shí)間過(guò)短，會(huì)使染色體皺縮，難以觀察。根據(jù)本試驗(yàn)的結(jié)果，棗樹染色體的低滲時(shí)間以1 h 為宜。

3.2結(jié)果探討本試驗(yàn)試管棗苗染色體出現(xiàn)24、48、23、22、21、19等多種數(shù)目。有關(guān)染色體變異的原因，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與核內(nèi)有絲分裂、核融合、核內(nèi)復(fù)制、多極有絲分裂及染色體斷裂等現(xiàn)象有關(guān)，是培養(yǎng)基中多種激素作用引起組培材料細(xì)胞分裂異常所致_[11]。類似的組培過(guò)程中染色體數(shù)目變異的情況還發(fā)生在金絲小棗、黑麥草、甜瓜、四合木、百合等植物中_[10]。也有人認(rèn)為染色體變異與材料來(lái)源、成苗途徑及培養(yǎng)時(shí)間等因素有關(guān)_[6]。由于本試驗(yàn)對(duì)所有材料都是平行處理，推測(cè)出現(xiàn)的少數(shù)染色體數(shù)目變化除細(xì)胞分裂異常原因外，還可能是在制片過(guò)程中沒(méi)有將細(xì)胞充分壓開，導(dǎo)致有的染色體粘在一起或相互重疊而看不清楚，也有可能是在壓片時(shí)用力過(guò)猛使染色體溢出細(xì)胞外。

本課題通過(guò)染色體制片和顯微鏡觀察相結(jié)合的方法對(duì)京棗試管苗的核型進(jìn)行了初步研究，試驗(yàn)結(jié)果證明該品種試管苗經(jīng)繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)后仍能夠穩(wěn)定遺傳，這為棗樹組培快繁的應(yīng)用、優(yōu)良品種選育以及組織培養(yǎng)育種等提供一定的理論參考，同時(shí)也為進(jìn)一步的染色體研究奠定了基礎(chǔ)。

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