孫婧靚　杜沙沙　鄭佳楠　鄒俠　姜長陽

摘 要：以根莖為材料，采用組織培養(yǎng)的方法，對遼細辛進行了芽生長培養(yǎng)、生長苗分化培養(yǎng)、不定芽分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，以及生根苗的移栽和定植的研究。結果表明：以爐灰渣為培養(yǎng)基支持物，1/2MS+ NAA0.1 mg·L-1+6-BA 0.8 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1是根莖生長苗培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基；2/3MS+蔗糖30 g·L-1+NAA0.3 mg·L-1+ ZT1.5 mg·L-1是生長苗分化培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基；1/2MS+蔗糖15 g·L-1+ABT2號1.0 mg·L-1+IBA0.6 mg·L-1是生根苗培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基；在溫室中移栽于營養(yǎng)缽中的生根苗成活率為97.8%，移栽于苗床上的成活率為98.3%；定植成活率為99.5%。定植的生根苗保持了野生遼細辛的所有植物學性狀。

關鍵詞：遼細辛；根莖；組織培養(yǎng)；生根苗

中圖分類號：Q813.1+2；S567.2 文獻標識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.006

遼細辛（Asarum heterotropoides Fr.Schmrdt var.mandshuricum（Masim.）Kitagawa）又稱北細辛、山細辛，屬于馬兜鈴科細辛屬多年生草本植物[1]，生長在腐殖質土層較厚的陰濕林下及陰山坡上，在大連地區(qū)的莊河市、瓦房店市有分布[2]。遼細辛的根莖做中草藥用，具有散寒祛風、止痛、溫肺化飲、通竅等功效，能治肺寒咳喘、風濕關節(jié)疼、頭疼、牙疼、鼻塞、鼻淵和口瘡等疾病[3-4]。將遼細辛曬干后磨成全草粉作為家禽的飼料添加劑，也能明顯降低家禽的發(fā)病率。由于遼細辛對人和家禽具有多種藥用價值，一直以來，人們都在大量地采挖藥用，使本來分布與數(shù)量就很少的遼細辛現(xiàn)在在大連的莊河和瓦房店已經(jīng)很難采到，幾近成為瀕危的野生藥用植物。為保護遼細辛的野生資源，筆者以其根莖為材料，進行了試管苗培養(yǎng)的研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

秋季，將在瓦房店市萬家?guī)X山坡上發(fā)現(xiàn)的多株遼細辛的生長位置做好標記。2009年4月中旬，待遼細辛的根莖即將萌發(fā)時將其挖回實驗室，將根莖的上細長根剪掉，再把具有待萌發(fā)芽的上部剪下2.0～2.5 cm作為試驗材料備用。

把剪下的具有待萌發(fā)芽的根莖上部，放到200 mL的磨口廣口瓶中，參見王宇等[5]滅菌方法進行滅菌。

培養(yǎng)條件參見翻白草的研究[6]。

1.2 方 法

1.2.1 根莖芽的生長培養(yǎng) 在超凈工作臺上，把滅菌后的根莖下部切掉，把具有待萌發(fā)芽的上部保留0.8 cm左右，分別接種到不加支持物的液體培養(yǎng)基，以胨力強度240 g·cm-2的瓊脂為支持物，以干凈河沙為支持物和以顆粒狀爐灰渣為支持物的1/2MS+ NAA0.1 mg·L-1+6-BA0.8 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1的4種培養(yǎng)基上，進行不同培養(yǎng)基支持物對根莖芽生長的影響試驗。重復2次，每種處理接種培養(yǎng)20個材料。

1.2.2 生長苗分化培養(yǎng) 把生長苗從基部切下后，接種到以2/3MS+蔗糖30 g·L-1為基本培養(yǎng)基，附加NAA0.3 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+ KT 1.5 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+ KT 2.0 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+6-BA1.5 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+6-BA2.0 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+ZT1.0 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+ ZT1.5 mg·L-1、NAA0.3 mg·L-1+ ZT2.0 mg·L-1 9種培養(yǎng)基上，進行不同濃度的生長調節(jié)劑組合對生長苗分化的影響試驗。重復2次，每種處理接種培養(yǎng)100個生長苗。

1.2.3 生根培養(yǎng) 把分化培養(yǎng)的2 000個高度在1.5 cm左右的不定芽從基部剪下，接種到以1/2MS+蔗糖15 g·L-1+ABT2號（2號生根粉）1.0 mg·L-1為基本培養(yǎng)基，附加濃度分別為0.3，0.6，0.9，1.2，1.5 mg·L-1的2，4-D、IBA、NAA和IAA 4種不同濃度生長素的培養(yǎng)基上，進行不同種類、不同濃度的生長素對生根苗培養(yǎng)的影響試驗。每種處理接種培養(yǎng)100個不定芽。

1.2.4 生根苗移栽與定植 3月20日，把培養(yǎng)的510株生根苗移栽到上層為干凈河沙的溫室營養(yǎng)缽中，其余540株移栽到上層為干凈河沙的溫室苗床上。

5月20日把移栽成活的1 024株生根苗一次性定植于大連旅順的上坡上。定植后除了移栽前松土和澆1次透水外，其它按照野生條件管理。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基支持物對根莖芽生長的影響

2次重復試驗獲得了基本一致的結果。培養(yǎng)到40 d時統(tǒng)計證明：對于這4種處理，在不加支持物的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)材料不生長。而在加入了3種支持物的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)根莖上都能生長為生長苗，但生長的程度不同。其中在以爐灰渣為支持物的培養(yǎng)基上的培養(yǎng)材料生長程度最好，不僅2次試驗生長苗的平均生長率均達到了95%，而且外觀上生長苗生長旺盛。觀察表明，在以爐灰渣為支持物的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)到第7天時，可見有的材料上部生長出小芽。之后，生長率不斷提高，小芽也逐漸生長為具有2～4個葉片的小苗。在上述試驗的基礎上，2010年，研究者一次性在以爐灰渣為支持物的1/2MS+ NAA0.1 mg·L-1+

6-BA0.8 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1這種培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)了1 100個待萌發(fā)的根莖段，40 d后獲得了1 051個生長苗。以上結果證明，以爐灰渣為培養(yǎng)基支持物， 1/2MS+ NAA0.1 mg·L-1+6-BA 0.8 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1這種培養(yǎng)基是遼細辛根莖生長苗培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

2.2 不同濃度生長調節(jié)劑組合對生長苗分化的影響

接種后培養(yǎng)至50 d時進行統(tǒng)計，結果見表1。在所試驗的9種不同濃度生長調節(jié)劑組合中， 在KT 與NAA的組合中培養(yǎng)的生長苗不能分化出不定芽，在NAA與6-BA的組合中生長苗分化的效果也不理想，而在不同濃度的NAA與ZT的組合中生長苗分化的效果較好。其中在NAA0.3 mg·L-1+ ZT1.5 mg·L-1組合中的分化效果最好，不僅分化率達到了99%，而且每個生長苗平均分化的不定芽數(shù)最多，分化的不定芽長勢最好。2次重復試驗的結果基本一致。在上述分化試驗的基礎上，研究者一次性在2/3MS+蔗糖30 g·L-1+ NAA0.3 mg·L-1+ ZT1.5 mg·L-1這一培養(yǎng)基上接種培養(yǎng)了600個生長苗，經(jīng)過50 d的培養(yǎng)試驗，培養(yǎng)分化出3 152個生長旺盛、高約1.2 cm的不定芽，其他結果也與2次重復試驗基本一致。以上試驗結果證明：NAA0.3 mg·L-1+ ZT1.5 mg·L-1這一生長調節(jié)劑組合是遼細辛生長苗分化培養(yǎng)的適宜生長調節(jié)劑組合，也就是說2/3MS+蔗糖30 g·L-1+NAA0.3 mg·L-1+ ZT1.5 mg·L-1這一培養(yǎng)基是遼細辛生長苗分化培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

2.3 不同種類、不同濃度生長素對不定芽生根培養(yǎng)的影響

接種后32 d觀察統(tǒng)計，結果見表2，在附加2，4-D與NAA 2種不同濃度生長素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的不定芽不能生長為生根苗；而在附加IBA和IAA 2種不同濃度生長素的培養(yǎng)基上，不定芽均能不同程度地生長為生根苗，其中，在附加不同濃度IBA的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的不定芽生長為生根苗的效果好于IAA。而在附加不同濃度IBA的培養(yǎng)基上，在濃度為0.6 mg·L-1的培養(yǎng)基生根培養(yǎng)的效果最好。不僅培養(yǎng)的試管苗平均高度最高、根數(shù)最多、生根率最高（達到了98%），而且所培養(yǎng)的生根苗長勢明顯較其它處理旺盛。在上述試驗的基礎上，又一次性培養(yǎng)了1 106個不定芽，并接種到1/2MS+蔗糖15 g·L-1+ABT2號（2號生根粉）1.0 mg·L-1+IBA0.6 mg·L-1培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，共培養(yǎng)出生長旺盛的試管苗1 087株，生根苗形成率達到了98.3%。以上生根培養(yǎng)的結果證明：IBA為0.6 mg·L-1的生長素濃度是遼細辛不定芽生根苗培養(yǎng)的理想生長素濃度，也就是說，1/2MS+蔗糖15 g·L-1+ABT2號（2號生根粉）1.0 mg·L-1+IBA0.6 mg·L-1培養(yǎng)基是遼細辛生根苗培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基。

2.4 生根苗移栽與定植

移栽于營養(yǎng)缽中的510株生根苗，成活了499株，成活率為97.8%；移栽于苗床上的540株生根苗，成活了531株，成活率為98.3%。

定植后58 d統(tǒng)計，成活了1 016株，成活率為99.5%。

定植成活的生根苗，7月上旬開始迅速旺盛地生長，翌年6月中旬開花，保持了野生遼細辛的植物學性狀。

3 討 論

在研究者對遼細辛進行研究前，前人已經(jīng)對細辛[7-9]和大花細辛[10]組織培養(yǎng)及試管苗培養(yǎng)進行了研究，盡管本研究對象遼細辛也與細辛和大花細辛都屬于同一屬（細辛屬）植物，但遼細辛不同培養(yǎng)階段所需要的適宜培養(yǎng)基卻出現(xiàn)了較大的差異。產生這種現(xiàn)象盡管與不同實驗室的培養(yǎng)環(huán)境不同有關，但更重要的還是由于基因型的差異而引起的。這說明，即使基因型相近的同一屬植物在進行組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)環(huán)境和適宜的培養(yǎng)基也會產生一定差異。

在本研究中，采用生長苗分化培養(yǎng)的方法進行快速繁殖，其繁殖速度是600個生長苗經(jīng)過50 d的分化培養(yǎng)，分化出3 152個生長旺盛的不定芽。50 d的繁殖系數(shù)為5.25。按照這種繁殖速度，1個生長苗1年能繁殖出約8萬個后代。這種繁殖速度完全能實現(xiàn)人們對遼細辛野生資源的保護和滿足人們栽培的需求。

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