徐玲玲　陳習　易立等

摘 要：以不同分叉和同一分叉不同高度的千層塔原植物為材料，采用超聲波輔助提取后利用高效液相色譜法對不同類別千層塔中石杉堿甲含量進行快速測定。結果顯示，石杉堿甲的含量表現(xiàn)為葉片>莖>根部；分叉越多、植株越高，石杉堿甲含量越高；三分叉以上、相對比較高的千層塔植株石杉堿甲含量較高，是野外千層塔原藥材采收的最佳類型。

關鍵詞：千層塔；形態(tài)；分叉；石杉堿甲；高效液相色譜

中圖分類號：S567.23+9.01文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）09-0036-03

千層塔（Huperzia serrata）為石杉科石杉屬植物蛇足石杉的干燥全草，始載于《植物名實圖考》，性味辛、苦、平，具有散瘀消腫、解毒和止痛的功效[1]。1972年我國科技工作者報道了從該植物中分離的石杉堿甲具有橫紋肌松弛作用[2]，之后大量研究發(fā)現(xiàn)石杉堿甲是一種高效、低毒、可逆和高選擇性的乙酰膽堿酯酶抑制劑[3]。由于千層塔所具有的顯著醫(yī)療作用和潛在的市場效益，1993年美國食品藥物管理局（FDA）批準石杉堿甲片屬類膽堿能劑，現(xiàn)已被國際上列為第二代乙酰膽堿酯酶（AChE）抑制劑之一[4]。隨著老齡化社會的到來，老年癡呆和記憶障礙成為臨床迫切需要解決的問題[5]，石杉堿甲作為新型AChE抑制劑應用前景十分廣闊，對千層塔的研究也受到了越來越多的關注[6]。

但是，野生千層塔生長緩慢[7]，當?shù)厝嗽诓墒諘r完全是“見者誅殺”，無論大小，走過之處，基本上無一生還。這樣的采收，不僅導致采集的原藥材質量良莠不齊，而且導致這一本身生長緩慢、數(shù)量不多的藥用植物處于瀕危的邊緣。因此，給當?shù)厮幟裉峁┮粋€合理、適時采收千層塔的依據(jù)非常重要。本研究在千層塔快速檢測工藝的基礎上，對不同形態(tài)野生千層塔中石杉堿甲的含量進行測定、對比，從藥材質量的角度提出合理采收千層塔的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 千層塔采于湖北恩施市盛家壩鄉(xiāng)麻茶溝村龍?zhí)翜辖M（34.2696576°N，109.1914236°E），由中國科學院植物研究所標本室鑒定為蛇足石杉（Huperzia serrata）。

1.1.2 試驗儀器 KQ-500VDE臺式三頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司，容量22.5 L，超聲頻率45 kHz，超聲功率500 W，功率可調（40%～100%），時間可調（1～480 min）；Waters Alliance高效液相色譜儀；電子天平，北京賽多利斯天平儀器廠。

1.1.3 試劑 石杉堿甲標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100243-200401）；乙腈、甲醇為色譜純（進口），水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理 將采集的千層塔先用自來水沖洗掉表面附著物，然后按照不同的分叉數(shù)、同一分叉數(shù)按照不同的株高（5～10、10～15、15～20 cm）進行分類，用剪刀分離葉片、莖段和根，標記。將不同類別的材料放入烘箱（60℃）干燥至恒重。取出，研磨，過60目篩，備用。

1.2.2 待測樣液制備 精確稱取一定量的不同類型的千層塔粉末，加入2%酒石酸，放入超聲清洗儀進行超聲提取。超聲完成后，用濾紙過濾至50 ml容量瓶，用2%酒石酸溶液定容，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾，濾液進行色譜測定。

1.2.3 超聲提取時間的確定 精確稱取一定量的三分叉千層塔葉片粉末6份，加入2%酒石酸，1份靜置過夜作為對照，其余5份進行超聲提取，超聲時間分別為0.5、1、2、3、4 h。然后按照1.2.2的方法進行處理，HPLC測定，以確定石杉堿甲提取的最佳超聲時間。

1.2.4 色譜條件 C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇+0.08 mol/L醋酸銨溶液（V/V=32∶8，用冰醋酸調pH至6.0）；流速1 ml/min；檢測波長308 nm；柱溫25℃；進樣量20 μl。

1.2.5 標準曲線繪制 精確稱取石杉堿甲對照品10 mg，甲醇溶解后定容至100 ml，然后用甲醇配制成5、10、20、40、80、100 mg/L的對照品溶液。分別進樣20 μl，以峰面積與對應濃度繪制標準曲線，得回歸方程：Y=6592.23654X+5.8330173，r=0.9993。

1.2.6 樣液測定 按上述色譜條件，量取20 μl樣液進樣，記錄峰面積，按線性回歸方程計算石杉堿甲的含量。

2 結果與分析

2.1 超聲時間對千層塔中石杉堿甲提取的影響

由表1可知，超聲提取3 h，從三分叉千層塔葉片中測得的石杉堿甲含量最高，因此確定超聲處理時間為3 h。

2.2 千層塔葉片、莖和根部石杉堿甲的含量比較

結果（表2）表明，對于三分叉的千層塔植株，葉片中石杉堿甲的含量最高，莖中次之，根部的石杉堿甲含量遠低于葉片和莖中。

2.3 千層塔不同分叉數(shù)對石杉堿甲含量的影響

由表3可知，隨著千層塔植株分叉數(shù)量的增多，葉片和莖中的石杉堿甲含量也隨之增高，三分叉以上的植株中石杉堿甲的含量差異不大。

2.4 千層塔植株高度對石杉堿甲含量的影響

3 結論與討論

超聲波提取法的操作簡單、成本低、效果好[8， 9]，但對不同實驗室的具體操作過程而言又不完全相同。本試驗通過比較不同的超聲處理時間對千層塔中石杉堿甲含量的影響，確定最佳的超聲處理時間為3 h，此時石杉堿甲提取率達到最大。在此基礎上對不同分叉數(shù)、不同株高千層塔植株中石杉堿甲含量進行測定，結果表明，分叉越多、植株越高，其石杉堿甲的含量越高，多于三分叉的植株其石杉堿甲含量差別不大；千層塔地上部分的石杉堿甲含量明顯高于地下部分，這與孫遠明等[10]的研究結果一致。

因此，在千層塔的實際采收過程中應該遵循：（1）選擇三分叉以上的高植株，不要采收分叉較少的植株；（2）盡可能不采挖根部，除因根部的石杉堿甲含量很低外，千層塔還可通過根部不定芽的形式進行自然繁殖。這對千層塔資源的保護性開發(fā)具有非常重要的指導意義。

參 考 文 獻：

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[2] 張君誠，邢建宏，宋育紅，等.藥用植物蛇足石杉研究新進展[J].中國野生植物資源， 2008， 27（2）： 1-4.

[3] Tang X C， He X C， Bai D L.Huperzine A： a novel acetylcholinesterase inhibitor [J]. Drugs Future， 1999， 24（6）：647-663.

[4] 王 斌， 何煦昌， 白東魯.老年癡呆癥藥物石杉堿甲類似物研究（Ⅴ）.光學活性（-）-1-甲基石杉堿甲的全合成[J].藥物學報， 1999， 34（6）： 434-438.

[5] Wolfe M S. Introduction to special issue on Alzheimers disease [J]. J. Med. Chem.， 2012， 55 （21）： 8977-8978.

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[8] 丁蕊艷， 李瑞菊， 陳子雷， 等. 氣相色譜法測定棉籽中高效氯氰菊酯殘留[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學， 2012， 44（8）： 116-118.

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[10]孫遠明， 余紅英， 楊躍生， 等. HPLC法測定蛇足石杉中石杉堿甲含量[J]. 中草藥， 2002， 33（12）： 1078-1080.