袁芳艷 劉澤文 周丹娜等

摘要：利用 RT-PCR擴(kuò)增H1N1亞型豬流感病毒HA基因，亞克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K中，構(gòu)建分泌型重組表達(dá)載體pPIC9K-HA。將線(xiàn)性化的pPIC9K-HA電轉(zhuǎn)化畢赤酵母菌GS115。將經(jīng)MD平板篩選和PCR鑒定的陽(yáng)性菌株用G418篩選多拷貝重組子。最后用1%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)重組子，經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot檢測(cè)， H1N1亞型豬流感病毒HA基因在畢赤酵母中成功得到了表達(dá)，產(chǎn)物約60.4KD，并具有免疫活性。本研究為進(jìn)一步研究豬H1N1亞型豬流感病毒HA基因的功能及檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：高職；養(yǎng)禽與禽病防治；實(shí)踐教學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2013）09-0005-03

豬流感（Swine influenza，SI）是由A型流感病毒所引起的豬的一種急性、高度傳染性呼吸道疾病。臨床特點(diǎn)為急性發(fā)熱，傳播迅速，發(fā)病率高，死亡率低，易引起繼發(fā)感染，是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病之一。 隨著集約化養(yǎng)豬規(guī)模的不斷擴(kuò)大，SI對(duì)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了較大的威脅。自從1918年美國(guó)首次報(bào)道SI的暴發(fā)，1930年Shope從豬體中分離到HINl亞型SIV，迄今為止，SI已遍布亞、美、歐等地[1]。豬作為流感病毒的"混合器"，在流感病毒跨種屬障礙而感染新宿主的過(guò)程中起著重要作用。2009年全球許多國(guó)家暴發(fā)了H1N1亞型流感，導(dǎo)致萬(wàn)余人死亡。SI嚴(yán)重威脅著人類(lèi)健康，并直接關(guān)系到公共衛(wèi)生及人類(lèi)的生命安全。

血凝素（HA）的裂解活性為病毒具有感染性和病毒在宿主體內(nèi)的傳播所必需。HA基因在流感病毒識(shí)別靶細(xì)胞表面受體及穿膜過(guò)程中起重要作用，刺激機(jī)體產(chǎn)生的中和抗體可以抵抗病毒感染，還可以刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)[2]。因此，對(duì)HA基因編碼的蛋白的研究具有重要意義。本試驗(yàn)克隆并在酵母表達(dá)了國(guó)內(nèi)分離H1亞型豬流感病毒HA，為研究HA蛋白功能及建立SI診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌（毒）株

大腸桿菌DH5α由本室保存；酵母-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pPIC9K載體、畢赤酵母菌株GS115/His-4均購(gòu)自Invitrogen公司；H1N1亞型豬流感病毒為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2 試劑

大腸桿菌DH5α、酵母菌GS115感受態(tài)細(xì)胞、T4 DNA連接試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物科技有限公司；RNA 提取試劑盒、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自Qiagen生物有限公司； DNA marker、蛋白質(zhì)marker、限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自大連寶生物公司；酵母氮源YNB、G418購(gòu)自北京普博欣公司；HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。試驗(yàn)中用到的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：

P1（擴(kuò)增HA成熟肽基因上游引物）：ATCTACGTAGACACACTATGT（SnaBI）

P2（擴(kuò)增HA成熟肽基因下游引物）：ATCGCGGCCGCATCATAAGTTCC（NotI）

α-factor：5'-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3'

3'AOX1：5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'

1.3 培養(yǎng)基

大腸桿菌LB培養(yǎng)基、酵母生長(zhǎng)培養(yǎng)基YPD、選擇培養(yǎng)基MD以及酵母誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基BMGY/BMMY均按美國(guó)Invitrogen公司的多拷貝畢赤酵母表達(dá)試劑盒的操作手冊(cè)配制。

1.4 H1N1亞型豬流感病毒RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

H1N1亞型豬流感病毒RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)分別按照按Qiagen RNAeasyTM 公司的RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)及反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.5 H1N1亞型豬流感病毒HA基因的擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 為模板，利用高保真度的Kod-plus DNA聚合酶和引物P1/ P2擴(kuò)增HA基因片段，反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min；35個(gè)循環(huán)（94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s）；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。取 5.0 μl PCR 產(chǎn)物，用 0.8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定后，將PCR回收產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

1.6 克隆載體pMD18T-HA的構(gòu)建

合成H1N1中截去N端信號(hào)肽序列的成熟肽基因（HA），用T4 DNA連接試劑盒將合成產(chǎn)物和克隆載體pMD18-T于16 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布卡納抗性平板，37 ℃培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)。小提質(zhì)粒用SnaBI/ Not I雙酶切鑒定，酶切正確的質(zhì)粒命名為pMD18T-HA，送上海生物工程有限公司測(cè)序。

1.7 穿梭質(zhì)粒pPIC9K-HA的構(gòu)建

用SnaBI/ Not I分別對(duì)HA和pPIC9K載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、用DNA凝膠回收試劑盒回收，連接，轉(zhuǎn)化DH5α，小提質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-HA。取pPIC9K-HA質(zhì)粒，經(jīng)SalⅠ單酶切、電泳回收，得到線(xiàn)性化的pPIC9K-HA，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8 酵母細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化及重組酵母菌株的篩選

參照Invitrogen公司的多拷貝畢赤酵母表達(dá)操作手冊(cè)進(jìn)行。為提高轉(zhuǎn)化效率，所制備的感受態(tài)細(xì)胞立即使用。

分別將10 μg線(xiàn)性化的pPIC9K-HA和pPIC9K質(zhì)粒，與80 μL畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞混勻后，注入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5 min，進(jìn)行電轉(zhuǎn)化（電轉(zhuǎn)參數(shù)為1500 V/25 μF/200 Ω）后，立即加入1 mL預(yù)冷的山梨醇混勻。取200～400 μL菌液涂布于營(yíng)養(yǎng)缺陷型MD平板，28～30 ℃倒置培養(yǎng)2～4 d。能在MD平板上生長(zhǎng)的菌落為His+轉(zhuǎn)化子。以α-factor/3'AOX1為引物，通過(guò)菌落PCR法確認(rèn)重組菌株，將PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)影印法依次接種到含G418濃度梯度為1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL的YPD培養(yǎng)基中，篩選多拷貝重組菌株。并在MD和MM培養(yǎng)基上篩選表型。

1.9 重組酵母菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)

從含G418的YPD平板上挑取高抗性酵母菌株的單菌落于5 mL BMGY培養(yǎng)基中，28 ℃搖床培養(yǎng)24 h，離心收獲細(xì)胞。將沉淀物用10mL BMMY培養(yǎng)基懸浮，繼續(xù)28 ℃搖床培養(yǎng)4 d，每24 h向培養(yǎng)基中補(bǔ)加甲醇至終濃度為1%，從而保證酵母菌株的持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)。將甲醇誘導(dǎo)4 d的酵母菌液，離心收集上清，進(jìn)行SDS-PAGE分析及Western-blot分析。Western-blot所用的一抗為鼠抗HA血清，二抗為HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG。

2 結(jié)果

2.1 H1N1亞型豬流感病毒HA成熟肽基因的RT-PCR擴(kuò)增

截去N端信號(hào)肽序列的H1N1亞型豬流感病毒成熟肽HA基因，擴(kuò)增所得片段大小約1647 bp，與預(yù)期大小相符，見(jiàn)圖1 。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將鑒定正確（圖2）的重組質(zhì)粒pMD18T-HA用SnaB I/ Not I進(jìn)行酶切，鑒定正確后回收HA片段并插入相應(yīng)酶切的pPIC9K中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-HA，并用SnaB I/ Not I進(jìn)行雙酶切鑒定。由圖3可知，酶切結(jié)果與預(yù)期結(jié)果9.3kb和1647bp相符。測(cè)序結(jié)果也顯示，重組穿梭質(zhì)粒pPIC9K-HA構(gòu)建正確。

2.3 重組酵母菌株的鑒定

對(duì)在MD平板上生長(zhǎng)的菌落，以P1/P2及α-factor/3'AOX1為引物，通過(guò)菌落PCR法初步鑒定重組菌株，用P1/P2擴(kuò)增出約1647bp的條帶，用引物α-factor/3'AOX1得到約1842bp（1647+195）的特意性條帶，表明轉(zhuǎn)化子基因組中確實(shí)整合有HA基因（圖4）。

PCR陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)G418抗性篩選，結(jié)果得到能在2.0 mg/mL G418濃度的YPD中生長(zhǎng)的高抗性菌株。且在MD和MM培養(yǎng)基上進(jìn)行表型篩選，挑取MD和MM培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)的菌落，即基因型為His+Mut+的菌株。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)

挑取pPIC9K-HA/GS115酵母菌株和pPIC9K/GS115酵母對(duì)照菌株，用1%的甲醇連續(xù)誘導(dǎo)4 d后，取培養(yǎng)基上清進(jìn)行SDS-PAGE及Western-blot分析。結(jié)果表明（圖5），HA基因在畢赤酵母中成功獲得了分泌表達(dá)，并且表達(dá)產(chǎn)物具有免疫活性。

3 討論

血凝素（HA）是一種重要糖蛋白，是流感病毒主要的表面抗原，主要有3個(gè)功能：①在感染之前與宿主細(xì)胞表面病毒特異性受體結(jié)合；②介導(dǎo)病毒囊膜與核內(nèi)膜的融合；③刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，產(chǎn)生免疫保護(hù)作用[3]。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因工程中最常用的工具。具有遺傳背景清楚、使用安全、操作簡(jiǎn)單、周期短、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，使用較廣泛。但是它缺少真核細(xì)胞的細(xì)胞器，沒(méi)有真核表達(dá)體系的蛋白翻譯后加工過(guò)程，不能進(jìn)行糖基化修飾，表達(dá)蛋白常常易于形成包涵體，常無(wú)其天然生物活性，需要進(jìn)行復(fù)性處理。

酵母作為另一類(lèi)異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)有其獨(dú)到之處。一方面，它屬于單細(xì)胞生物，因而保留了細(xì)菌系統(tǒng)易于操作和生長(zhǎng)快速的特點(diǎn)；另一方面，酵母又具有真核生物細(xì)胞的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，故具有翻譯后正確的加工和修飾功能[4]。畢赤酵母的醇氧化酶1基因的啟動(dòng)子具有強(qiáng)誘導(dǎo)性和強(qiáng)啟動(dòng)性，適于外源基因的高水平誘導(dǎo)表達(dá)[5]。而且畢赤酵母分泌的內(nèi)源性蛋白少，培養(yǎng)基中雜蛋白含量低，表達(dá)產(chǎn)物既可以在胞內(nèi)積累也可以直接分泌于培養(yǎng)基中，不需要經(jīng)過(guò)細(xì)菌破碎以及復(fù)性過(guò)程，易于純化。酵母表達(dá)系統(tǒng)適用范圍很廣，具有不含特異性的病毒，不存在內(nèi)毒素殘留，背景少等特點(diǎn)，隨著酵母表達(dá)載體、宿主菌株和發(fā)酵工藝的不斷改進(jìn)，酵母表達(dá)系統(tǒng)已成為臨床和工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白的最佳選擇[6]，也是高活性基因工程生物制品研制的重要技術(shù)。

酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)受許多因素的影響，比如：外源基因A+T的組成及密碼子的偏愛(ài)性，A+T含量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止；整合的拷貝數(shù)，一般而言，基因多拷貝轉(zhuǎn)化子的表達(dá)量要高于單拷貝轉(zhuǎn)化子[7]。本研究利用畢赤酵母pPIC9K載體帶有Kan抗性基因，在含高濃度G418（4.0mg/mL）的抗性平板篩選出高拷貝整合的轉(zhuǎn)化子，成功地分泌表達(dá)了H1N1亞型豬流感HA蛋白，為HA蛋白功能研究及SI診斷方法的建立打下基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 余 華. 豬流感病毒分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，

2010， 31（S）：208-212.

[2] 謝金文，苗立中，沈志強(qiáng). 豬流感病毒蛋白研究進(jìn)展[J]。中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2009，36（11）：157-161.

[3] 趙孟孟，潘俊斌，王 衡. 豬流感病毒血凝素基因的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2010， 37（11）：69-72.

[4] 姚清俠. 豬α干擾素、豬β干擾素與豬γ干擾素的抗病毒活性及其免疫佐劑的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2007.

[5] CEREGHINO J L， CREGG J M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. FEMS Microbiol Rev， 2000， 24（1）： 45-66.

[6] CREGG J M， CEREGHINO J L， SHI J， et al. Recombinant protein expression in Pichia pastoris[J]. Mol Biotechnol， 2000， 16（1）： 23-52.

[7] 王黎明，王 琦，梅汝鴻.巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2004，24（2）：42-45.