歐陽(yáng)亦華 顏 劍

（1廣東省廣州市番禺區(qū)人口和計(jì)劃生育服務(wù)站藥劑科，廣州511400；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧530001）

紅芪多糖含量測(cè)定方法研究

歐陽(yáng)亦華1顏 劍2

（1廣東省廣州市番禺區(qū)人口和計(jì)劃生育服務(wù)站藥劑科，廣州511400；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧530001）

目的 建立一種紅芪多糖含量測(cè)定的方法。方法采用80%乙醇回流除去蛋白、氨基酸、單糖、雙糖、低聚糖等雜質(zhì)，并用熱水分離提取紅芪多糖，以葡萄糖作為換算因子，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用蒽酮-硫酸分光光度法對(duì)紅芪多糖含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果檢測(cè)波長(zhǎng)為625nm，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y＝6.3263*c＋0.1271，R2＝0.9917，線性范圍為0～0.2mg／ml。該測(cè)定方法供試液在2h內(nèi)顯色穩(wěn)定，精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，平均回收率100.53%，RSD＜3.0%，測(cè)得紅芪多糖的含量為6.62%。結(jié)論蒽酮-硫酸法操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確，可靠，可作為紅芪多糖的測(cè)定。

紅芪；多糖；含量；測(cè)定

紅芪（Radix hedysari）為多序巖黃芪的干燥根，又名巖黃芪、晉芪、獨(dú)根，其與黃芪同科不同屬，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［1］。中醫(yī)理論認(rèn)為紅芪性溫，味甘，其功效主要包括補(bǔ)氣生陽(yáng)、固表止汗、消腫利尿、斂瘡生肌等［2］。近三十年，較多學(xué)者對(duì)紅芪化學(xué)成分及其藥理活性進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)紅芪中含有多糖、皂苷、黃酮、生物堿、有機(jī)酸及微量元素等，其藥理活性包括增強(qiáng)免疫、強(qiáng)心利尿、抗衰老、抗病毒、抗菌、抗炎等［3］。多糖（polysaccharide）是一類具有廣泛藥理活性天然高分子化合物，由10個(gè)以上單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成，在生物機(jī)體內(nèi)多糖是維持正常生命活動(dòng)的基本物質(zhì)。文獻(xiàn)研究表明，紅芪多糖具有促血管生成、抗自由基、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗腫瘤、抗衰老等活性［4］。本研究針對(duì)紅芪多糖的含量測(cè)定研究，建立一種準(zhǔn)確、快速、可行的測(cè)定方法，為開(kāi)發(fā)利用紅芪多糖提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；BS423S電子天平，德國(guó)賽多利斯公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州中誠(chéng)儀器制造有限公司；N-1100V-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化；D5-RZ型離心沉淀機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DZG-6050型真空干燥箱，南京華奧干燥設(shè)備有限公司。

1.2 材料葡萄糖對(duì)照品來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定所（批號(hào)：110833-200904），無(wú)水乙醇、正丁醇、石油醚、濃硫酸、蒽酮、丙酮、乙醚、氯仿試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為雙蒸水。藥材紅芪購(gòu)自甘肅。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 精制紅芪多糖的制備稱紅芪，粉碎過(guò)篩，取50目粉約10g，精密稱定，加入索氏提取器，用100ml石油醚80℃回流提取2h脫脂，過(guò)濾，棄去濾液。之后將濾渣揮干溶劑放入索氏提取器，繼續(xù)加入200ml 80%乙醇90℃回流1h，過(guò)濾，棄去濾液。之后將濾渣揮干溶劑放入索氏提取器，繼續(xù)加入400ml雙蒸水，于沸水浴中回流1h，過(guò)濾，將濾液于4000 r／min離心分離10min，取上清液濃縮，用Sevage［5］法除去蛋白。之后用自來(lái)水透析48h，雙蒸水透析24h，向透析液中加入無(wú)水乙醇使乙醇濃度達(dá)80%，醇沉過(guò)夜。之后4000 r／min離心分離醇沉液，將沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚各洗滌2次，真空干燥至恒重，即得紅芪多糖。稱重紅芪多糖，密封冷藏備用。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定吸取一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和紅芪多糖溶液，分別置于10ml具塞試管中，按照蒽酮-硫酸試劑顯色方法顯色，用雙蒸水作空白對(duì)照，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和紅芪多糖溶液分別于500～750nm范圍掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品試劑250.0mg，用少量雙蒸水溶解，放置250ml容量瓶中，用雙蒸水定容至刻度，搖勻，配成1.0mg／ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取2.5、5.0、10.0、15.0、20.0ml標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于100ml容量瓶中，用雙蒸水定容至刻度，配成不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取1ml不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液試管中，并以1ml雙蒸水作空白，各試管中分別加入3.3mg／ml的蒽酮-硫酸溶液4ml，立刻搖勻，置于冰水中放冷，之后置于沸水浴中加熱5min，放冷至室溫，于波長(zhǎng)625nm處測(cè)定OD值，依據(jù)不同的OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。

2.4 換算因子的測(cè)定精密稱取紅芪多糖10.0mg，用少量雙蒸水溶解，放置50ml容量瓶中，用雙蒸水定容至刻度，搖勻，配成紅芪多糖測(cè)定液。于波長(zhǎng)625nm處測(cè)定其OD值（A），由回歸方程求出由葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的紅芪多糖中葡萄糖含量，按如下?lián)Q算公式進(jìn)行計(jì)算：

注：w為稱取紅芪多糖的質(zhì)量（mg），c為紅芪多糖中葡萄糖濃度（mg／ml），d為多糖的稀釋倍數(shù)（ml）。

2.5 紅芪多糖制備稱取紅芪50目粉末5g，置索氏提取器，加入80ml 80%乙醇，90℃水浴回流提取1h，熱濾，用80%熱乙醇洗滌濾渣3次。濾渣置干燥器中揮干溶劑后取出，加80ml蒸餾水超聲溶解，90℃水浴中浸提1h，熱濾，濾渣按上述操作提取1次，熱濾后合并濾液，4000r／min離心分離，取上清液置于200ml容量瓶中，用雙蒸水稀釋至刻度，搖勻。吸取10ml置于50ml容量瓶中，用雙蒸水稀釋至刻度，搖勻作為紅芪多糖供試液備用。

3 結(jié)果

3.1 最大吸收波長(zhǎng)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和精制紅芪多糖樣品溶液，經(jīng)蒽酮-硫酸顯色后用UV2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在500～750nm范圍掃描。掃描結(jié)果表明：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和紅芪多糖樣品溶液均在625nm處有最大吸收，確定該波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。結(jié)果如圖1。

圖1 波長(zhǎng)的確定

3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備以標(biāo)準(zhǔn)品葡萄糖為濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為：y＝6.3263*c＋0.1271，R2＝0.9917，線性范圍為0.025～0.2mg／ml，其中y為OD值，c為葡萄糖濃度。

3.3 換算因子干燥后的精制紅芪多糖用水溶解后，在625nm處測(cè)定其OD值＝0.582，由回歸方程計(jì)算其葡萄糖含量為0.072mg／ml，按換算公式計(jì)算得換算因子f＝2.78。

3.4 精密度實(shí)驗(yàn)精確吸取同一樣品試液5份，各1.0ml，置于具塞試管中，加雙蒸水1ml，搖勻，按照蒽酮-硫酸法測(cè)定OD值，平行測(cè)定5次，結(jié)果表明，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＝0.88%，表明精密度良好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)（%）

3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精確吸取紅芪多糖供試液5份，各1.0ml，置于具塞試管中，加雙蒸水1ml，搖勻，按照蒽酮-硫酸法測(cè)定OD值，完全顯色后，每隔15min記錄一次OD值，考察2h內(nèi)穩(wěn)定性。不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量結(jié)果RSD＝0.42%，表明紅芪多糖供試液的吸光度在2h內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（%）

3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)稱取6份1.0g干燥過(guò)50目篩紅芪粉末，按2.5方法進(jìn)行處理，制取6份樣品溶液，各取1ml樣品溶液于具塞試管中，加雙蒸水1ml，搖勻，按照蒽酮-硫酸法測(cè)定OD值，平行測(cè)定3次取平均，得到標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＝1.21，重復(fù)性好，可靠性高。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性收實(shí)驗(yàn)（%）

3.7 加樣回收實(shí)驗(yàn)稱取3份1.0g干燥過(guò)50目篩紅芪粉末，按2.5方法進(jìn)行處理，每組做3份平行，各取1ml樣品溶液于具塞試管中，加雙蒸水1ml，搖勻，并分別加入一定量葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照蒽酮-硫酸法測(cè)定OD值，計(jì)算回收率平均值為100.53%，RSD＝2.37%。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收實(shí)驗(yàn)（%）

3.8 多糖含量測(cè)定精確稱取3份紅芪50目篩粉末，各1g，按照2.5的方法制備紅芪多糖，精確吸取樣品溶液1.0ml，分別置于具塞試管中，加雙蒸水1ml，搖勻，按照蒽酮-硫酸法測(cè)定OD值，根據(jù)回歸方程，計(jì)算紅芪多糖含量＝cdf／w×l00%＝1.53%［w為稱取樣品質(zhì)量（mg），c為紅芪多糖中葡萄糖濃度（mg／ml），d為多糖的稀釋倍數(shù)（ml）］。以蒽酮-硫酸法測(cè)得紅芪多糖含量為6.62%，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 紅芪多糖含量測(cè)定（%）

4 討論

本文通過(guò)采用精制紅芪多糖測(cè)定紅芪多糖中葡萄糖的含量，并確定其換算因子，該方法能有效避免直接用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)引起誤差。通過(guò)對(duì)紅芪多糖含量測(cè)定方法進(jìn)行的精密度、穩(wěn)定性和加樣回收率實(shí)驗(yàn)，表明該多糖含量測(cè)量方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確度，且該方法穩(wěn)定。本方法操作簡(jiǎn)單易行，方便快捷，穩(wěn)定可靠，靈敏度較高，所需儀器、試劑價(jià)格低廉，可以在常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行，本方法適用于紅芪多糖的測(cè)定，為紅芪多糖產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)理論。

［1］羅文蓉，楊扶德，張雅聰．紅芪的生藥學(xué)研究［J］．時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004，15（3）：157．

［2］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（一部）［S］．2010年版．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：142．

［3］楊林，譚玉玲．中藥紅芪研究現(xiàn)狀［J］．中外醫(yī)療，2010，（5）：120-121．

［4］黨子龍，劉小花，趙安娜．紅芪多糖HPS4-1A的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征研究及分子構(gòu)象初步分析［J］．中草藥，2013，44（2）：141-146．

［5］徐靜靜，艾訓(xùn)儒，李琴，等．正交試驗(yàn)優(yōu)選延齡草多糖提取工藝研究［J］．黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2011，34（6）：9-10．

St u d y o n t he De t e r mina tio n Me t h o d o f Poly s ac c ha rid e Con t e n t in Ra dix He d y s a ri

Ouyang Yihua1Yan Jian2(1 Department of p harmacy,p opulation and Family p lanning Service Station,panyu D istrict,Guangzhou,Guangdong p rovince,511400,China; 2 College of pharmacy,Guangxi University of Traditional Chinese M edicine,Nanning,Guangxi p rovince,530001,China)

Objective To establish a radix hedysari Polysaccharide determination method．MethodsRadix hedysari polysaccharide was extracted by 80%ethanol to remove out protein，amino acids，monosaccharides，disaccharides，oligosaccharides and other impurities．a(chǎn)nd the polysaccharide used glucose as a conversion factor，then obtained the standard curve．The polysaccharide was determined with anthrone-sulfuric acid spectrophotometry．ResultsThe detection wavelength was 625nm，and the glucose standard curve regression equation was y＝6.3263*c＋0.1271，R2＝0．9917，and linear range was 0～0.2mg／ml．The method was simple and feasible for the color stability of test solution within 2h．The precision and stability was good．The average recovery was 100.53%，and all RSD＜3.0%．The polysaccharide content in radix hedysari is 6.62%．ConclusionThe anthrone-sulfuric acid method is simple，reproducible，accurate and reliable，which can be preferably used as the method of determination of radix hedysari polysaccharide．

Radix hedysari；Polysaccharides；Content；Determination

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.20.103

1672-2779（2013）-20-0149-03

楊 杰

2013-08-17）