李鳳嬌，毛中偉，黎瑞君，劉天增，張巨明

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，廣東 廣州 510642)

雜交狗牙根(Cynodondactylon×Cynodontransvaalensis)在我國南方地區(qū)高爾夫球場上廣泛使用，其質(zhì)地細(xì)密、顏色深綠，但管理要求高。為了使草坪保持良好的顏色和生長狀態(tài)而施用大量氮肥，不僅成本高，還會對環(huán)境造成污染。如何在減少氮肥使用量的同時維持草坪的正常生長，減少氮素對環(huán)境的影響，成為高爾夫球場可持續(xù)發(fā)展的重要課題。

植物內(nèi)生固氮菌是一類定殖于健康植物體內(nèi)，與宿主植物進(jìn)行聯(lián)合固氮的微生物，通過固氮作用為植物提供氮素，同時可產(chǎn)生生理活性物質(zhì)促使宿主適應(yīng)環(huán)境，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用潛力[1]。

植物內(nèi)生固氮菌存在于一些非豆科植物中，到目前為止，已有文獻(xiàn)報道的內(nèi)生固氮菌均為內(nèi)生固氮細(xì)菌[1-2]。近年來在甘蔗(Saccharumofficinarum)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)等作物和一些牧草中發(fā)現(xiàn)了多種具有固氮功能的內(nèi)生細(xì)菌，引起了學(xué)術(shù)界的高度關(guān)注，現(xiàn)已成為生物固氮研究的活躍領(lǐng)域[2-3]。近年來，研究人員已經(jīng)從不同植物中分離和量化各種各樣的固氮細(xì)菌，他們可能有益于植物的氮營養(yǎng)[4-6]。當(dāng)植物與固氮細(xì)菌聯(lián)合或共生時，直接受益于生物固氮作用，內(nèi)生固氮菌的礦化作用則使植物間接受益。

本研究嘗試將從野生狗牙根(C.dactylon)中分離出的內(nèi)生固氮菌接種至人工培育的雜交狗牙根體內(nèi)，摸索適宜的接種濃度和接種方法，在少施或不施氮肥的情況下通過觀測草坪生長狀態(tài)變化，探索利用植物內(nèi)生固氮菌的可能性，以期為降低養(yǎng)護(hù)成本，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)高爾夫球場可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗材料 供試植物為天堂419雜交狗牙根，取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城寧西教學(xué)試驗基地。采用口徑12 cm，高10 cm的塑料花盆栽培，基質(zhì)為過2 mm篩的純砂。

接種的內(nèi)生固氮菌從19份野生狗牙根根、莖、葉中分離出，從中篩選出8份具代表性的固氮酶活性不同的菌株并進(jìn)行固氮酶活性分析。選擇固氮酶活性最高(256.09 μmol·h-1·mL-1)、中等(8.29 μmol·h-1·mL-1)、最低(0.80 μmol·h-1·mL-1)的3種混合菌液，分別將其用半固體無氮培養(yǎng)基培養(yǎng)并作為供試菌液(每次接種前用分光光度計調(diào)節(jié)至OD600≈1)。

1.2試驗處理 本試驗共設(shè)計3種菌液處理、3種接種方法[7-8]；并設(shè)計兩種尿素處理，以不接種為對照，共20個處理，每個處理4個重復(fù)，共80盆。

3種菌液處理分別為固氮酶活性最高的菌液處理(Bh)、活性中等的菌液處理(Bm)和活性最低的菌液處理(Bl)；3種接種方法分別為菌液浸泡(S)、菌液浸泡+澆灌菌液6次(Si1)、菌液浸泡+澆灌菌液12次(Si2)；尿素處理設(shè)不施和施尿素兩處理，施尿素量為8 g·m-2。

1.3試驗方法

1.3.1盆栽 參照吳彥奇等[9]的方法。盆栽時，手工撕開種苗，每盆10個草莖，均勻扦插于盆。然后覆約0.5 cm厚的中細(xì)砂，反復(fù)鎮(zhèn)壓。種植當(dāng)天，按P2O5、K2O各10 g·m-2給各盆基質(zhì)中施磷肥和鉀肥。試驗開始后，僅尿素處理每月施尿素8 g·m-2，其余處理不再施肥。試驗過程中，定期定量澆水，人工拔除雜草，發(fā)生病害用百菌清防治，蟲害用毒死蜱防治。

1.3.2菌液制備 內(nèi)生固氮菌的保存參照田宏等[10]、路國兵等[11]、盧鎮(zhèn)岳等[12]的方法，內(nèi)生共固氮菌的活化參照李倍金等[13-14]、馮宏等[15]的方法。

1.3.3接種 從供試材料中取出800個草莖用于盆栽前處理，每盆10個。將其中720個草莖均分為3份，分別在固氮酶活性最高、中等和最低的3種內(nèi)生固氮菌菌液中浸泡24 h后進(jìn)行盆栽，每種菌液用量為67.824 mL；種植一個月后，給其中24盆澆灌相應(yīng)菌液直到第90天，每種菌液澆灌8盆，每盆用量為2.826 mL，每半個月澆灌一次(共澆灌菌液6次，記為Si1)；同時給另外24盆澆灌菌液直至清盆前半個月(210 d)停止?jié)补?同上)(共澆灌菌液12次，記為Si2)；剩余24盆不做菌液澆灌處理(記為S)。

1.3.4測定指標(biāo)及方法 給天堂419雜交狗牙根接種各菌液之后，土壤脲酶活性的測定采用比色法[16]、土壤有效氮的測定采用堿解擴(kuò)散法[17-18]，分別于0、30和210 d清盆時測定土壤脲酶活性和有效氮；地上部全氮量的測定采用雙氧水-硫酸快速消化、擴(kuò)散定氮法[17-19]，分別于0、210 d清盆時測定地上部全氮量，同時在210 d清盆時測定地下生物量；草坪顏色的測定，采用9分制對草坪顏色進(jìn)行打分[20-21]，于30、75、135和210 d定期觀測記錄草坪綠色程度。內(nèi)生固氮菌固氮酶活性的測定、計算參照田宏等[10]、李倍金等[13-14]、馮宏等[15]的方法，內(nèi)生固氮菌菌群密度的測定和計數(shù)參照夏娟娟[22]、張曉波[23]的方法。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)均以平均值表示，用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)圖表分析；用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行多重比較，各平均數(shù)的多重比較采用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗法。

2 結(jié)果與分析

2.1土壤脲酶活性和土壤有效氮 結(jié)果表明，生長前期，各接種菌液類型對土壤脲酶活性、有效氮均存在顯著影響(P<0.05)，但后期影響差異不顯著(表1、表2)。雖然接種方法并不影響土壤脲酶活性，但卻影響有效氮含量，在30 d時，S、Si1處理的有效氮顯著大于Si2處理及CK(P<0.05)(表2)。接種30、210 d，尿素顯著增加了土壤脲酶活性(P<0.05)(表1),但對有效氮影響不顯著。

表1 不同菌液類型、不同尿素處理對土壤脲酶活性的影響Table 1 Effects of bacterial liquid and urea treatment on soil urease activity mg·g-1

表2 不同菌液類型、不同接種方法對土壤有效氮的影響Table 2 Effects of bacterial liquid and inoculation methods on soil available N mg·kg-1

2.2地上部全氮量、地下生物量 接種后210 d時，接種菌液Bm、Bh的地上部全氮量與Bl、CK差異明顯，且均遠(yuǎn)高于接種Bl；接種方法S地上部全氮量高于Si1和Si2，即植物生長過程中澆灌內(nèi)生固氮菌液對天堂419雜交狗牙根地上部全氮量無顯著影響。無論是菌液類型處理還是接種方法處理，它們的地上部全氮增加量都高于對照(表3)。

其中，Bm地下生物量最多，與Bh、Bl差異顯著(P<0.05)；尿素對地下生物量影響顯著(P<0.05)(表4)。

2.3草坪顏色 不同菌液處理草坪顏色在各次測定中存在顯著差異(P<0.05)，且Bm、Bl效果相對較好。結(jié)果表明，接種不同菌液可使草坪在一定時期內(nèi)保持良好的顏色，其中生長初期以接種Bm效果好于Bl，生長后期則相反(圖1)。

不同接種方法草坪顏色也在各次測定中存在顯著差異(P<0.05)(圖2)，除了接種75 d外，其他測定時間基本表現(xiàn)為接種處理組草坪顏色分值高于對照，結(jié)果表明不同接種方法可使草坪保持良好顏色，但3種接種方法效果無明顯差異。

表3 菌液類型和接種方法對天堂419雜交狗牙根地上部全氮量的影響Table 3 Effects of bacterial liquid and inoculation methods on aboveground Total N of hybrid bermudagrass g·kg-1

表4 菌液類型、接種方法和尿素對處理210 d后天堂419雜交狗牙根的地下生物量的影響Table 4 Effects of bacterial liquid, inoculation methods and urea treatment on underground biomass of hybrid bermudagrass after inoculation 210 d ×10-2 g·cm-2

圖1 菌液處理對天堂419雜交狗牙根草坪顏色的影響Fig.1 Effects of bacterial liquid on turf color of hybrid bermudagrass

圖2 不同接種方法對天堂419雜交狗牙根草坪顏色的影響Fig.2 Effects of inoculation methods on turf color of hybrid bermudagrass

處理30、135 d時，尿素對草坪顏色影響差異不顯著，而處理75、210 d時尿素對草坪顏色有顯著影響(P<0.05)(圖3)。

圖3 不同尿素處理對天堂419雜交狗牙根草坪顏色的影響Fig.3 Effects of urea treatment on turf color of hybrid bermudagrass

2.4地上部內(nèi)生固氮菌固氮酶活性和菌群密度 天堂419雜交狗牙根接種后，定期測定地上部內(nèi)生固氮菌固氮酶活性和菌群密度。生長前、后期，菌液Bm對酶活影響顯著大于Bh、Bl和CK(P<0.05)(表5)；且Bm或Bh接種的天堂419雜交狗牙根地上部內(nèi)生固氮菌菌群密度明顯大于其它菌液(表6)。生長前期，接種方法S對酶活影響較Si2、Si1和CK的大(表7)。

3 討論

大田試驗表明，高氮肥料可能威脅著內(nèi)生聯(lián)合固氮的自然發(fā)生[24-26]。高氮肥條件下種植的植物，固氮菌不能保證植物的氮供應(yīng)[27-29]，因為高濃度結(jié)合態(tài)氮抑制了固氮酶合成和(或)活性[30]。然而，如果解除結(jié)合態(tài)氮抑制行為后，固氮基因操控還是有可能在田間高氮肥下促進(jìn)生物固氮(BNF)作用的[31-32]。因此，本研究設(shè)計了施尿素處理和不施尿素對照。結(jié)果表明，尿素處理對接種天堂419雜交狗牙根地上部內(nèi)生固氮菌固氮酶活性及菌群密度的影響不顯著，但是尿素處理受接種菌液類型以及接種方法的影響，它們之間的交互作用很有可能利于酶活提高和菌群密度的增加。

表5 不同菌液類型對地上部內(nèi)生固氮菌固氮酶活性的影響Table 5 Effects of bacterial liquid on nitrogenase activity of aboveground endophytic diazotrophs μmol·h-1·mL-1

表6 菌液處理對地上部內(nèi)生固氮菌固氮菌菌群密度的影響Table 6 Effects of bacterial liquid on flora density of aboveground endophytic diazotrophs lg(cfu·g-1)

表7 不同接種方法對地上部內(nèi)生固氮菌固氮酶活性的影響Table 7 Effects of inoculation methods on nitrogenase activity of aboveground endophytic diazotrophs μmol·h-1·mL-1

本研究中固氮酶活性中等的菌液(Bm)對天堂419雜交狗牙根地上部內(nèi)生固氮菌固氮酶活性的影響明顯大于其它菌液和對照，說明菌液Bm接種至天堂419雜交狗牙根后表現(xiàn)出較高的固氮能力。有研究顯示，接種了越南伯克氏菌(Burkholderiavietnamiensis)、重氮營養(yǎng)葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)、織片草螺菌Z67(HerbaspirillumseropedicaeZ67)的組培甘蔗內(nèi)定殖了大量接種細(xì)菌，達(dá)到每克根鮮質(zhì)量115 000 cfu[33-35]。本研究中，與接種前相比，各菌液處理地上部內(nèi)生固氮菌菌群密度于接種30 d后明顯增加，但75、210 d后菌群密度部分呈減少趨勢。說明在整個接種內(nèi)生固氮菌過程中，其菌群密度并非持續(xù)增加，可能受土壤環(huán)境、氣候等多種因素影響，不同時期呈現(xiàn)不同的表現(xiàn)[36]。

從天堂419雜交狗牙根地上部內(nèi)生固氮菌固氮酶活性來說，在生長前、中期，菌液浸泡的接種方法(S)對酶活性的影響顯著大于其它接種方法和對照；然而到生長后期，菌液浸泡+澆灌菌液12次的接種方法(Si2)對酶活的影響顯著大于其它接種方法和對照。從地上部內(nèi)生固氮菌固氮酶活性測定結(jié)果可判斷，菌液浸泡是一種相對較好的接種方法，既省事，成本也沒有其它接種方法高。

天堂419雜交狗牙根接種后，接種不同菌液可使草坪在一定時期內(nèi)保持良好的顏色，其中生長初期接種Bm效果好于Bl，但是生長后期則相反，可能與生長后期植株體內(nèi)定殖的固氮菌固氮效率降低有關(guān)[30]；不同接種方法可使草坪顏色在各次測定中存在顯著差異(P<0.05)，其它測定時間基本是接種處理組草坪顏色分值高于對照，除了處理75 d外。說明不同接種方法可使草坪保持良好顏色，但處理75 d時與正處于高溫天氣有關(guān)，可能影響了草坪微生物正常活動[37-39]。處理75、210 d尿素對草坪顏色有顯著影響，可能是由于接種菌液在天堂419雜交狗牙根體內(nèi)發(fā)揮固氮作用，促進(jìn)葉綠素合成[40]。

本試驗只是一項初步研究，試圖探索將從野生狗牙根中分離到的內(nèi)生固氮菌接種至栽培品種天堂419雜交狗牙根上的可行性。值得指出的是，氮肥是影響內(nèi)生固氮菌生存生長及接種效果的一個重要因素，本研究選擇了目前運動場草坪常規(guī)施用量，在試驗設(shè)計上僅考慮到氮是否影響內(nèi)生固氮菌的接種效果，卻沒有進(jìn)一步設(shè)置氮肥水平梯度去探究氮肥與菌液濃度的最佳組合；其次，菌液濃度、接種方法及氮素之間可能存在交互作用，接種方法、尿素處理究竟如何影響菌液發(fā)揮其固氮能力；此外，本研究中接種方法對菌群密度的影響差異不顯著，可能是浸泡時間不足，24 h究竟能不能為固氮菌侵染草莖提供充足時間。以上問題還有待進(jìn)一步研究。

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