張維，胡新喜，熊興耀，聶先舟，何長(zhǎng)征*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410128；3.Pot at o Research Cent er,A gri cul t ure and A gri-Food Canada,850 Li ncol n Road,P.O.Box 20280,Frederi ct on,N B E3B 4Z7,Canada）

馬鈴薯A病毒研究進(jìn)展

張維1,2，胡新喜1,2，熊興耀1,2，聶先舟3，何長(zhǎng)征1,2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410128；2.湖南馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410128；3.Pot at o Research Cent er,A gri cul t ure and A gri-Food Canada,850 Li ncol n Road,P.O.Box 20280,Frederi ct on,N B E3B 4Z7,Canada）

馬鈴薯A病毒（Potato virus A，PVA）是馬鈴薯生產(chǎn)上危害較嚴(yán)重的病毒之一。PVA已知的寄主為茄科植物，在馬鈴薯上引起的癥狀與氣候條件、馬鈴薯品種和PVA的株系有關(guān)。PVA基因組與其他PVY屬已知序列的病毒核苷酸序列同源性在53%～58%之間，編碼的11種蛋白在基因組復(fù)制、蛋白加工、蚜蟲傳毒、系統(tǒng)移動(dòng)以及與寄主組分互作等方面具有各自的功能。馬鈴薯對(duì)PVA的抗性分為過敏抗性（HR）和極端抗性（ER）兩類，植物對(duì)PVA的抗性機(jī)制主要分為顯性基因介導(dǎo)的抗性、隱性基因介導(dǎo)的抗性、RNA介導(dǎo)的抗性。PVA的致病機(jī)理、PVA抗性基因挖掘和抗PVA轉(zhuǎn)基因新策略將是今后的研究重點(diǎn)。

PVA；致病癥狀；基因組；抗性

馬鈴薯A病毒（Potato virus A，PVA）屬于馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）的成員，其病毒粒子為絲狀，長(zhǎng)約730 nm，直徑15 nm[1]。1914年首次報(bào)道了關(guān)于馬鈴薯A病毒病的的病害癥狀[2]，1932年被正式命名[3]。

PVA是馬鈴薯生產(chǎn)上危害較嚴(yán)重的病毒病之一,馬鈴薯感染PVA后可造成高達(dá)40%的減產(chǎn)[4]。由于至少有7種蚜蟲以非持久性的方式傳播PVA，而這些蚜蟲在我國(guó)又比較常見，因此在我國(guó)PVA流行的可能性很大，具有較大風(fēng)險(xiǎn)[5]，2007年P(guān)VA被列入《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》[6]。我國(guó)關(guān)于PVA的相關(guān)研究報(bào)道還很少[7]，因此本文將從PVA致病癥狀、基因組結(jié)構(gòu)和功能以及致病與抗病機(jī)理等方面的研究進(jìn)行綜述。

1 PVA致病癥狀研究

PVA的已知寄主植物為茄科作物，如醋栗番茄（Lycopersicon pimpinellifolium）、假酸漿（Nicandra physalodes）、普通煙（Nicotiana tabacum）、德伯尼煙（N.debneyi）、特大管煙（N.megalosiphon）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、馬鈴薯野生種（S.demissum）、馬鈴薯種間雜交種（S.demissum×S.tuberosum）、樹番茄（S.betacea）等[8]。接種PVA后，醋栗番茄表現(xiàn)出局部和系統(tǒng)壞死，假酸漿出現(xiàn)嚴(yán)重的系統(tǒng)花葉、壞死和矮化，煙草表現(xiàn)出明脈癥狀。馬鈴薯野生種S.demissum、馬鈴薯種間雜交種A6（S.demissum× S.tuberosum cv.Aquila）的離體葉片接種后出現(xiàn)星狀壞死斑點(diǎn)[6,9]。

PVA侵染馬鈴薯后與馬鈴薯Y病毒?。≒VY）的癥狀相似，在多數(shù)品種上引起輕微花葉，斑駁、葉脈凹陷而使葉面粗糙，葉脈或脈間呈現(xiàn)不規(guī)則的淺色斑，有些葉緣產(chǎn)生皺褶呈波浪狀，有些敏感的品種表現(xiàn)為頂端壞死,病株枝條向外彎曲，呈開散狀，偶爾會(huì)表現(xiàn)矮化[10]。PVA引起的花葉癥狀在強(qiáng)日照季節(jié)（比如夏季）表現(xiàn)不如在冷涼氣候下明顯，有時(shí)甚至完全沒有癥狀表現(xiàn)[11]，但PVA和馬鈴薯X病毒（PVX）復(fù)合感染則癥狀非常明顯，可引起嚴(yán)重皺葉[9]，PVA和PVY復(fù)合感染也引起嚴(yán)重的花葉癥狀[12]。

PVA在馬鈴薯上引起的癥狀與品種有關(guān)，將PVA接種到12個(gè)馬鈴薯品種上，‘Foxton’沒有被感染，‘Estima’、‘Pentland Crown’、‘Pentland Ivory’、‘Mariva’4個(gè)品種無癥狀表現(xiàn)，‘Desiree’表現(xiàn)輕微花葉，‘Maris Bard’出現(xiàn)褪綠斑，‘King Edward’、‘Marisa Piper’、‘Cara’、‘Tomasa Condemayta’、‘Yungay’5個(gè)品種則表現(xiàn)為頂端壞死[13]。不同株系的PVA在同一品種的馬鈴薯上引起的致病癥狀也不同，將PVA接種到馬鈴薯品種‘King Edward’上，根據(jù)‘King Edward’的反應(yīng)，可將PVA分成四組：第一組（如株系U、Her）在植株的上部葉片上引起典型的壞死癥狀；第二組（如株系A(chǔ)li）能引起葉片斑駁，但不產(chǎn)生壞死癥狀；第三組（如株系B11，TamMV）不引起任何病癥；第四組（如株系Can,Pen,Pon,A20）引起植株矮化、葉片發(fā)黃[14]。

2 PVA的基因組結(jié)構(gòu)和功能研究

PVA病毒的基因組是由9565個(gè)核苷酸組成的單鏈正義RNA分子，包含一個(gè)9177個(gè)堿基的開放閱讀框架（ORF），編碼一個(gè)含有3059個(gè)氨基酸的多聚蛋白，5'-末端共價(jià)結(jié)合基因組連接蛋白（Viral genome-linked protein，VPg），3'-末端是一個(gè)以多聚腺苷酸（Poly(A)）結(jié)尾的非編碼區(qū)（3'NTR）[15-17]。多聚蛋白最終裂解成11個(gè)成熟的功能蛋白[14]，從N端到C端分別為第一蛋白（First protein，P1)、輔助成分-蛋白酶（Helper component-proteinase，HC-pro）、第三蛋白（Third protein，P3）、第一個(gè)6K蛋白（6K1）、圓柱狀內(nèi)含體蛋白（Cylindrical protein，CI）、第二個(gè)6K蛋白（6K2）、VPg、核內(nèi)含體蛋白a（Nuclear inclusion body a protein，NIa-pro）、核內(nèi)含體蛋白b（Nuclear inclusion body b protein，NIb）和外殼蛋白（Coat protein，CP）[18]。在馬鈴薯Y病毒屬中新發(fā)現(xiàn)P3蛋白編碼區(qū)內(nèi)移碼讀框翻譯形成第十一個(gè)蛋白，命名為PIPO19]。有關(guān)它的功能現(xiàn)在還不清楚[20]（圖1）。對(duì)5個(gè)已測(cè)全序列的PVA病毒分離物（B11、Her、Ali、U和TamMV）分析得出，它們核酸序列的同源性為84%，多聚蛋白的同源性為95%，TamMV的基因組變異最大，與其它四個(gè)分離物的核酸同源性為84%，而其它四個(gè)分離物的同源性在97%以上[18]，這可能與TamMV來自樹番茄（S.betacea），而其它4個(gè)分離物來自馬鈴薯有關(guān)[14]。在PVA基因組中，CI蛋白和6K2蛋白的氨基酸序列最保守[14]，P1和P3蛋白的氨基酸序列最不保守[15]。PVA與其他PVY屬已知序列的病毒相比，其核苷酸序列同源性在53%～58%之間，氨基酸序列同源性在65%～71%之間[15]。

圖1 PVA基因組結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 Schematic diagram of PVA genome

PVA編碼的蛋白的功能研究報(bào)道還很有限，但就馬鈴薯Y病毒屬而言，編碼的蛋白的主要功能已有系統(tǒng)總結(jié)（表1）[21]。

酵母雙雜交試驗(yàn)證明，PVA的P1和CI、P3和NIb之間存在相互作用[22]，PVA功能蛋白的體外相互作用分析也表明，P1、P3與病毒基因組復(fù)制相關(guān)的功能蛋白（CI、VPg、NIa-pro、NIb)、P1與HC-pro存在互作[23]，因此，可以推測(cè)PVA的P1、P3蛋白可能影響病毒基因組的復(fù)制。

表1 馬鈴薯Y病毒屬編碼蛋白的主要功能Table 1 Main functions of proteins encoded by potyviruses

HC-pro蛋白與蚜蟲傳毒有關(guān)，蚜蟲傳播PVA需要HC-pro蛋白的保守基序KITC（對(duì)應(yīng)第52～55位氨基酸）和基序PTK（對(duì)應(yīng)第310～312位氨基酸）[24]，對(duì)馬鈴薯Y病毒屬的HC-pro研究分析，KITC基序促進(jìn)病毒粒子與蚜蟲上額刺針結(jié)合，而PTK基序與CP N末端DAG基序互作，共同參與蚜蟲傳毒，PVA可能也是以此方式進(jìn)行蚜蟲傳毒[25]。此外，PVA的HC-pro蛋白與馬鈴薯、煙草的翻譯起始因子eIF4E及其異構(gòu)體eIF（iso）4E都存在互作，但與eIF（iso）4E的互作更強(qiáng)[24]，HC-pro蛋白C端的4E結(jié)合基序的突變會(huì)弱化HC-pro和翻譯起始因子eIF（iso）4E的互作和PVA對(duì)植物的毒性[24]，表明PVA被蚜蟲傳播的能力和對(duì)寄主的侵染能力都與病毒的HC-pro蛋白有關(guān)。

酵母雙雜交試驗(yàn)也證明，CI與HC-pro存在強(qiáng)烈的相互作用[22]，電鏡觀察結(jié)果顯示，在PVA的尖端結(jié)構(gòu)中，CI可能與HC-pro結(jié)合在一起，并且這種與運(yùn)輸復(fù)合物結(jié)合的CI可能是PVA尖端結(jié)構(gòu)的主要組分[26]。

6K2 蛋白中單個(gè)氨基酸替換使PVA-M(PVA的一個(gè)株系，對(duì)假酸漿無侵染能力)具備維管移動(dòng)的能力和系統(tǒng)侵染性[27]，去除6K2蛋白的不同部位或者在不同位置插入6個(gè)組氨酸殘基都會(huì)抑制PVA對(duì)本生煙（N.benthamiana）和煙草的系統(tǒng)侵染能力[28]，表明6K2蛋白與PVA的系統(tǒng)移動(dòng)能力有關(guān)。

VPg蛋白作為PVA表達(dá)的一種特異調(diào)控子，具有促進(jìn)病毒RNA擴(kuò)增和翻譯產(chǎn)物積累的作用[29]。VPg蛋白可能是韌皮部蛋白，并在庫(kù)葉的伴胞中促進(jìn)病毒卸載[30]。VPg蛋白對(duì)于PVA系統(tǒng)侵染植物非常重要，VPg蛋白中單個(gè)氨基酸的替換（Val116Met）可以使不具侵染能力的PVA分離物能夠系統(tǒng)侵染假酸漿[27]，His118Tyr則可以使PVA能夠侵染具有PVA株系特異性抗性的馬鈴薯野生種S.commersonii[31]。同時(shí)VPg蛋白與寄主蛋白的互作在PVA的侵染中起到了重要作用，VPg蛋白C端氨基酸替換（Ser185Leu）降低了馬鈴薯野生種S.commersonii接種葉片中PVA的積累并且延遲系統(tǒng)侵染，但在煙草中則沒有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，這是因?yàn)轳R鈴薯野生種S.commersonii的磷酸化激酶能夠區(qū)分兩種VPg蛋白，而煙草的磷酸化激酶則不能[32]。研究還發(fā)現(xiàn)，PVA的VPg蛋白與核仁纖維蛋白存在互作，抑制本生煙的核仁纖維蛋白基因的表達(dá)可以減少PVA在本生煙中的積累[33]；寄主的酸性核糖體蛋白P0和翻譯起始因子eIF（iso）4E、PVA的VPg蛋白共同促進(jìn)病毒的翻譯[34]。

PVA的NIa-pro蛋白既調(diào)控順式裂解，也調(diào)控反式裂解，但主要是順式裂解。P3/6K1、CI/6K2和VPg/ NIa-pro連接位點(diǎn)的裂解慢，而6K1/CI、6K2/VPg、NIa-pro/NIb和NIb/CP連接位點(diǎn)的裂解則很迅速[35]。

PVA的CP含有269個(gè)氨基酸，與其他通過蚜傳的Y病毒屬病毒的氨基酸序列同源性達(dá)到66%以上[15]。CP蛋白N-端第5～7位氨基酸序列Asp-Ala-Gly（DAG）是蚜蟲傳播PVA所必需的，如果該序列突變?yōu)锳sp-Ala-Ser（DAS），則PVA失去蚜蟲傳播能力，且接種葉片中PVA的積累增加[36]。體外分析表明，蛋白酶CK2催化的磷酸化強(qiáng)烈抑制PVA CP和RNA的結(jié)合[16]，PVA要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間移動(dòng)和長(zhǎng)距離移動(dòng)，CP蛋白必需被CK2磷酸化[37]。

3 植物抗PVA的研究

馬鈴薯對(duì)PVA的抗性分為過敏抗性（HR）和極端抗性（ER）兩類，具有過敏抗性的馬鈴薯品種感染PVA后表現(xiàn)為壞死性病變，在植株體內(nèi)通常能夠檢測(cè)到病毒；具有極端抗性的馬鈴薯感染PVA后往往無任何癥狀，植株中檢測(cè)不到病毒或者病毒含量極低[17,38]。馬鈴薯中這兩類抗性都由單個(gè)顯性基因控制，一個(gè)極端抗性基因可能對(duì)多個(gè)病毒株系，甚至2～3種病毒表現(xiàn)出復(fù)合抗性，如Rysto具有對(duì)PVY、PVA和馬鈴薯V病毒（PVV）的抗性[39]，PVA的所有極端抗性基因和部分過敏抗性基因也表現(xiàn)出對(duì)PVY的抗性，這可能是多個(gè)抗性基因連鎖在一起，如PVA的極端抗性基因Raadg和過敏性抗性基因Naadg定位在馬鈴薯第11號(hào)染色體上，與PVY的極端抗性基因Ryadg、Rysto所在的區(qū)域相連[17,40]。

PVA分離物PVA-U、PVA-M在帶有PVA過敏性抗性基因Na的馬鈴薯品種上一般產(chǎn)生系統(tǒng)壞死癥狀，但在同樣具有過敏性抗性基因Na的馬鈴薯品種‘King Edward’上，PVA-U產(chǎn)生系統(tǒng)壞死癥狀，PVA-M則產(chǎn)生斑駁癥狀，這表明這兩種PVA的過敏性抗性基因并不相同[17]。

馬鈴薯品種‘Shepody’對(duì)PVA具有高度抗性，與其他單基因控制的抗性不同的是，這種抗性受兩對(duì)顯性互補(bǔ)基因控制[41]，用PVA摩擦接種‘Shepody’時(shí)，不產(chǎn)生癥狀，表現(xiàn)為極端抗性。但將感染PVA的接穗嫁接‘Shepody’時(shí)，則出現(xiàn)葉片失綠、莖部和薯塊出現(xiàn)壞死條紋或壞死斑等癥狀，表現(xiàn)出類似過敏性抗性的反應(yīng)[42]，并伴隨著幾丁質(zhì)酶A和B、葡聚糖酶B以及PR-10a等病程相關(guān)基因的表達(dá)[43]。

病毒需要利用寄主的組分和細(xì)胞基質(zhì)才能完成其侵染循環(huán)，因此，當(dāng)寄主組分，即感病因子缺失或者發(fā)生突變，相應(yīng)的病毒因子就無法識(shí)別，從而導(dǎo)致寄主對(duì)病毒的抗性反應(yīng)，這種抗性遺傳是隱性遺傳的[44]。很多介導(dǎo)馬鈴薯Y病毒屬抗性的隱性基因都是eIF4E和eIF（iso）4E的等位基因，已知PVA的VPg蛋白和HC-pro蛋白都與真核生物翻譯起始因子eIF（eIF4E、eIF(iso)4E）存在互作[29,24,34]，替換真核生物翻譯起始因子中的氨基酸就會(huì)導(dǎo)致很多植物對(duì)包括PVA在內(nèi)的馬鈴薯Y病毒屬病毒的隱性抗性[45]，這可能是通過抑制翻譯起始、復(fù)制以及阻止病毒在細(xì)胞間運(yùn)輸?shù)葯C(jī)制來實(shí)現(xiàn)的[44]。

將來自病毒基因組的基因轉(zhuǎn)化寄主，能使寄主產(chǎn)生對(duì)該病毒的抗性，這種抗性是由病毒的RNA發(fā)生沉默而產(chǎn)生的，由于這種沉默是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄階段，所以又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默,這種抗性也稱為RNA介導(dǎo)的抗性[46]。用PVA的5'非編碼區(qū)和編碼CP蛋白序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化本生煙，獲得對(duì)PVA高水平抗性的植株，但這種抗性植株不抗PVY，被PVY侵染后，其對(duì)PVA的抗性受到抑制[47]，此外，用PVA基因組的其他基因轉(zhuǎn)化寄主，如CI[48]、P1[49]、VPg[49]、HC-pro[50]等，都能使寄主獲得對(duì)PVA的抗性。這種RNA介導(dǎo)的抗性機(jī)制在馬鈴薯以及其他作物對(duì)病毒病的抗性改良中具有廣泛的應(yīng)用前景。

4 展望

隨著植物病毒研究的深入和研究技術(shù)的發(fā)展，作者認(rèn)為今后PVA的研究重點(diǎn)應(yīng)放在以下三個(gè)方面，一是研究PVA蛋白與寄主組分的互作關(guān)系，更深入地了解PVA的基因功能及調(diào)控，闡明病毒基因和寄主基因在病毒復(fù)制、運(yùn)動(dòng)及致病過程中的功能與作用方式，進(jìn)一步揭示PVA的致病機(jī)理。二是利用分子生物學(xué)新技術(shù)，挖掘植物抗PVA的新基因。三是開展抗PVA轉(zhuǎn)基因新策略、新技術(shù)的探索，為抗病毒轉(zhuǎn)基因作物新品種的培育提供理論基礎(chǔ)。

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1.3 圖像后處理 采用GE公司提供的后處理工作站的Functool 9.4軟件進(jìn)行后處理，進(jìn)行相位校正、基線校正、ppm轉(zhuǎn)換后獲得1H-MRS中各代謝物在波譜線中的峰下面積。在1H-MRS的圖像中，橫坐標(biāo)表示共振頻率，單位為ppm，縱坐標(biāo)表示信號(hào)強(qiáng)度。以肌酸(Cr)為參考標(biāo)準(zhǔn)，將其他化學(xué)物質(zhì)峰下面積與Cr峰下面積相比，計(jì)算右側(cè)基底節(jié)區(qū)的乙酰天門冬氨酸/Cr(NAA/Cr)、NAA/膽堿(NAA/Cho)、乳酸/Cr(Lac/Cr)比值。

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Research Progress on Potato Virus A

ZHANG Wei1,2，HU Xinxi1,2，XIONG Xingyao1,2,NIE Xianzhou3,HE Changzheng1,2＊
(1.College of Horticulture and Landscape,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan 410128,China;2.Hunan Potato Research Center,Changsha,Hunan 410128,China;3.Potato Research Center,Agriculture and Agri-Food Canada,850 Lincoln Road,P.O.Box 20280,Fredericton,NB E3B 4Z7,Canada)

Potato virus A(PVA)causes serious viral disease in potato production.The host range of PVA is restricted to Solanaceae,and symptoms caused by PVA on potato depend on climatic conditions,potato cultivar and PVA strain.Overall nucleotide sequence ofPVAidentity compared with othercompletely sequenced potyvirus genomes is between 53%and 58%. The PVA genome is expressed as a single polyprotein that is subsequently cleaved to 11 mature proteins functioned in DNA replication,protein processing,aphid transmission,systemic movement and interaction with host component.Potato defense against viruses is mainly highly devided into hypersensitive response(HR)and extreme resistance(ER),and the resistance is mediated by dominant gene,recessive gene or RNA.The pathogenic mechanism,resistance gene mining and new transgenic strategies againstPVAwould be the focus of the future research.

PVA;pathogenic symptoms;genome;resistance

S532

A

1672-3635（2013）02-0100-06

2013-02-26

湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目基金（CX2011B307）。

張維（1987-），男，碩士，從事馬鈴薯病毒檢測(cè)。

何長(zhǎng)征，教授，從事馬鈴薯分子生物技術(shù)研究，E-mail∶hecz@hotmail.com。