李鵬飛 梁克偉 辛 陽 張忠良

（中國刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035）

4種紙張汗?jié)撝讣y顯現(xiàn)方法對(duì)STR分型影響的研究

李鵬飛 梁克偉 辛 陽 張忠良

（中國刑警學(xué)院 遼寧 沈陽 110035）

研究常用4種紙張汗?jié)撝讣y顯現(xiàn)方法對(duì)DNA提取的影響，特別是紙張上顯現(xiàn)后殘缺指紋中提取人類DNA的可行性。篩選出一個(gè)既能顯現(xiàn)指紋又能對(duì)提取人類脫落細(xì)胞DNA影響最小的技術(shù)方法，應(yīng)用于法庭個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定。

法醫(yī)物證學(xué) 汗?jié)撝讣y PCR擴(kuò)增 STR分型

人類的指紋終生不變，沒有兩個(gè)完全相同的指紋，是世界上公認(rèn)的也是最重要的個(gè)體特征之一，被廣泛應(yīng)用于刑事偵查和保密工作之中。紙張上很容易獲得指紋，但是因?yàn)楦鞣N條件限制我們常常得到的是不完整的指紋，給我們刑偵工作帶來困難。

人類的DNA分析應(yīng)用于法醫(yī)物證鑒定是20世紀(jì)法庭科學(xué)領(lǐng)域最引人注目的成就，是利用分子生物學(xué)方法，對(duì)案件所涉及的生物檢材的DNA進(jìn)行分型，達(dá)到個(gè)人識(shí)別或親子鑒定的目的。世界上有120多個(gè)國家和地區(qū)已應(yīng)用DNA分析技術(shù)辦案，解決刑事案件、民事糾紛問題，以及追查尸體身源，包括戰(zhàn)爭(zhēng)及大型災(zāi)難中罹難者的個(gè)人識(shí)別等，個(gè)人同一認(rèn)定接近100%。

現(xiàn)代研究顯示：與人體接觸過的物體表面常常附有體表脫落的上皮細(xì)胞成分。有試驗(yàn)證明，人體只要接觸物體表面5秒鐘以上，即有可能細(xì)胞遺留在物體上，也就是說指紋當(dāng)中有可能留下核DNA及線粒體DNA。

有鑒于此實(shí)際情況常常讓刑事技術(shù)人員陷入兩難處境，如果顯示指紋就提不了人類的DNA，如果先提人類的DNA就破壞了指紋。如果能篩選出在指紋顯示后的紙張上特別是殘缺指紋中找到提取人類DNA的方法，探索DNA復(fù)合擴(kuò)增的可能性及擴(kuò)增條件，把兩大個(gè)體識(shí)別技術(shù)結(jié)合起來，對(duì)我們偵查工作無疑帶來極大的幫助。

由于指紋中DNA含量少，不同指紋顯現(xiàn)方法對(duì)DNA提取的影響大小各異，所以目前國內(nèi)系統(tǒng)的指紋DNA提取技術(shù)一直沒有建立起來，遇到這類案件時(shí)不能進(jìn)行相應(yīng)的檢驗(yàn)。隨著社會(huì)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，紙張與人之間的關(guān)系也越來越密切，所以，紙張上指紋顯示方法對(duì)人類DNA提取影響研究顯得越來越迫切，特別是在一些較為重大的的案件，能夠?yàn)榉ㄍサ膶徟刑峁┐_切的證據(jù)，對(duì)政法機(jī)關(guān)的刑事或民事案件具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

5%chelex-100、蛋白酶K、IdentifilerTM復(fù)合擴(kuò)增熒光STR試劑盒。

1.2 主要儀器

溫箱、離心機(jī)、振蕩器、GeneAmp system 9700（ABI）。

3130 Genetic Analyzer（ABI公司）。

1.3 主要軟件

GeneMapper IDv3.1軟件。

1.4 指紋顯現(xiàn)試劑

DFO、茚三酮、硝酸銀、碘。

1.5 其他材料

牛皮紙張（東莞市文通紙業(yè)有限公司）。

1.6 方法

1.6.1 汗?jié)撝讣y的制備及顯現(xiàn)

20名自愿者每人在牛皮紙指定位置用左手食指指腹按壓5枚指紋，其中一枚指紋作為空白對(duì)照，這枚指紋的壓力和按壓時(shí)間保證能夠作出全部基因位點(diǎn)，其他4枚指紋按照這個(gè)壓力和時(shí)間采集，每枚指紋進(jìn)行一種顯色。這樣每種顯色方法有20枚指紋。顯現(xiàn)方法有DFO、茚三酮、硝酸銀、碘熏，具體操作方法見《痕跡檢驗(yàn)學(xué)試驗(yàn)手冊(cè)》。

1.6.2 5%chelex-100提取純化法

將顯現(xiàn)的指紋用剪刀從紙張上剪下來，剪碎放在1.5ml的離心管中，每個(gè)管中加20μl的5%chelex-100，Pk2μl，56℃溫浴 50min，振蕩 10s，煮沸15min，振蕩10s，13000轉(zhuǎn)離心5min。

1.6.3 STR復(fù)合擴(kuò)增

IdentifilerTM復(fù)合熒光STR試劑盒擴(kuò)增，熱循環(huán)條件：95℃11min(94℃1min 59℃1min 72℃1min)×28循環(huán)60℃60min 4℃保溫

1.6.4 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)

分型在16道3130型分析儀（ABI USA）上進(jìn)行，用Gene mapper IDv3.1軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

4種紙張汗?jié)撝讣y顯現(xiàn)方法STR成功率統(tǒng)計(jì)

3 討論

3.1 各種紙張汗?jié)撝讣y顯現(xiàn)方法對(duì)STR分型的影響

汗?jié)撝讣y之所以能夠提取DNA，不是因?yàn)榻腔纳掀ぜ?xì)胞，因?yàn)檫@些細(xì)胞的細(xì)胞核已經(jīng)消失，而是因?yàn)槟切┪赐耆腔鸵衙撀涞募?xì)胞，以及那些手指接觸身體別的部位所脫落的有核細(xì)胞，所以其量是非常微弱的，同時(shí)紙張表面比較光滑，脫落的細(xì)胞不易隨著汗液粘附于紙張表面。本研究通過對(duì)紙張汗?jié)撝讣y顯現(xiàn)后，分析STR分型，發(fā)現(xiàn)用DFO、茚三酮、硝酸銀顯現(xiàn)的紙張汗?jié)撝讣y分別有50%、56%、63%的STR位點(diǎn)未能顯現(xiàn)，效果不是很理想，而碘熏方法則100%有STR位點(diǎn)顯現(xiàn)，并且在20例中有15例16個(gè)基因位點(diǎn)完全顯現(xiàn)。

DFO顯現(xiàn)方法的原理：DFO化學(xué)名為1，8-二重氮-9芴酮，DFO與α-氨基酸發(fā)生反應(yīng)，在白光照射下，生成淡紅色化合物，手印紋印非常弱，在多波段光源藍(lán)綠光（515nm～530nm）的激發(fā)下，通過橙色濾光鏡觀察，手印呈橙紅色熒光。該方法只是與汗液中的氨基酸發(fā)生反應(yīng)，雖然不會(huì)破壞細(xì)胞核中的核酸大分子，但形成的絡(luò)合物成分與chelex-100混合時(shí)，離心不能將其沉淀，影響DNA擴(kuò)增，STR分型效果不好。

圖1 DFO顯現(xiàn)后DNA圖譜

茚三酮顯現(xiàn)的原理：茚三酮與汗液中的物質(zhì)成分的化學(xué)反應(yīng)很復(fù)雜，但是主要是與汗液中的氨基酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成醛（RCHO）、氨（NH3）、二氧化碳（CO2），同時(shí)茚三酮被還原，NH3與還原的茚三酮及過量的茚三酮縮合，生成深紫色的絡(luò)合物（魯赫曼紫），從而顯出紫色的手印紋線。該方法只是與汗液中的氨基酸發(fā)生反應(yīng)，不會(huì)破壞細(xì)胞核中的核酸大分子。但是由于形成大分子成分與chelex-100混合時(shí)，離心不能將其完全沉淀，其中的化學(xué)成分在擴(kuò)增時(shí)可影響DNA的擴(kuò)增，STR分型效果不好。

圖2 茚三酮顯現(xiàn)后DNA圖譜

硝酸銀顯現(xiàn)原理：硝酸銀顯現(xiàn)方法是利用硝酸銀與汗液中的氯離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成氯化銀沉淀，氯化銀在強(qiáng)光作用下極易分解為銀離子和氯氣，從而將手印顯現(xiàn)出來，但是隨著光照的加強(qiáng)，反應(yīng)會(huì)不斷進(jìn)行，銀離子的增多會(huì)使物質(zhì)變黑，因此掌握光照的強(qiáng)度和時(shí)間，避免反應(yīng)過度，影響顯現(xiàn)效果。由于重金屬離子影響DNA聚合酶活性，不能有效地進(jìn)行PCR擴(kuò)增，顯現(xiàn)指紋后有些位點(diǎn)峰沒有出來。同時(shí)光照的強(qiáng)度和時(shí)間也不容易控制，在一定程度上也造成了細(xì)胞核DNA的損壞。

圖3 硝酸銀顯現(xiàn)后DNA圖譜

碘熏顯現(xiàn)的原理：手印物質(zhì)中的油脂和汗垢物質(zhì)對(duì)碘有粘附作用而產(chǎn)生物理性附著；同時(shí)手印物質(zhì)中的不飽和脂肪酸吸收碘而發(fā)生化學(xué)反應(yīng)生成二碘硬脂酸，使紫褐色的碘蒸氣和手印物質(zhì)中的皮脂和油脂發(fā)生反應(yīng)變成棕黃色，從而將手印顯現(xiàn)出來。由于碘在常溫下能升華，產(chǎn)生物理附著的碘若不固定將很快蒸發(fā)，并且碘所產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)具有可逆性，故碘顯現(xiàn)的手印很快就會(huì)消失，要及時(shí)采取一定措施固定和提取。碘熏法顯現(xiàn)手印不會(huì)損壞客體，碘對(duì)細(xì)胞的損壞不大，并且chelex-100提取時(shí)，碘一部分已經(jīng)蒸發(fā)，所以不會(huì)影響擴(kuò)增和電泳，實(shí)驗(yàn)結(jié)果峰的顯現(xiàn)效果理想。

圖4 碘熏顯現(xiàn)后DNA圖譜

3.2 提高紙張汗?jié)撝讣yDNA檢出率的方法及建議

由于紙張上指紋中的DNA含量特別微量，再加上紙張表面比較光滑，所以紙張汗?jié)撝讣yDNA提取量非常少，而能否提取足量的DNA是成功進(jìn)行PCR分型的必要條件。為了盡量提高紙張汗?jié)撝讣yDNA的檢出率，在實(shí)際案件中應(yīng)該注意：①顯現(xiàn)方法優(yōu)化。DFO、茚三酮、硝酸銀等試劑顯現(xiàn)用量盡量少，足夠覆蓋指紋為止，這樣既可以減少試劑沖刷造成的細(xì)胞損耗，也可避免這些試劑中化學(xué)成分對(duì)DNA提取和擴(kuò)增的影響；碘熏顯現(xiàn)拍照后，一段時(shí)間等碘蒸發(fā)后再提取DNA，這樣可以避免碘對(duì)DNA提取和擴(kuò)增的影響。②轉(zhuǎn)移方法。紙張是滲透性的載體，所以為了避免細(xì)胞的進(jìn)一步損耗，可以采取將紙張指紋部分剪下，轉(zhuǎn)移到離心管中，運(yùn)用5%chelex-100連帶紙張一起提純，這樣可以避免丟棄紙張?jiān)斐傻募?xì)胞丟失，同時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)溫浴時(shí)間和煮沸時(shí)間，使DNA釋放更加完全。③小體系提取。本實(shí)驗(yàn)分別采用10ml、20ml體系，圖譜質(zhì)量為 10ml體系 ＞20ml體系。Michelle等對(duì)縮小體系進(jìn)行研究，采用5ml體系，DNA的檢驗(yàn)靈敏度能夠達(dá)到0.03ng。④低拷貝模板PCR技術(shù)應(yīng)用。由于指紋DNA量非常微量，所以擴(kuò)增時(shí)應(yīng)增加IdentifilerTM復(fù)合熒光STR試劑盒規(guī)定的DNA模板量，同時(shí)增加循環(huán)次數(shù)，但是增加PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)太多，出現(xiàn)雜帶機(jī)率增加，本實(shí)驗(yàn)通過研究表明，PCR擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)最有效，因此擴(kuò)增時(shí)，采用模板梯度擴(kuò)增，綜合分析結(jié)果，避免錯(cuò)誤。⑤增加電泳DNA模板量。由于紙張指紋DNA模板量非常微弱，常規(guī)模板量可能達(dá)不到理想的峰高，所以可以適當(dāng)增加電泳模板量。

通過對(duì)DFO、茚三酮、硝酸銀、碘熏四種紙張汗?jié)撝讣y顯示方法的比較，我們建議在實(shí)踐中盡量采用碘熏的方法，以降低對(duì)DNA提取的影響。

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注：本文系公安部應(yīng)用創(chuàng)新項(xiàng)目“指紋顯現(xiàn)方法對(duì)DNA提取的影響研究”的階段性研究成果，項(xiàng)目編號(hào)：2011YYCXXJXY122。