吳 婷牛青山潘永峰辛 陽(yáng)

（1 中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035；2 沈陽(yáng)市公安局刑警支隊(duì) 遼寧 沈陽(yáng) 110002）

免提取直接擴(kuò)增技術(shù)在現(xiàn)場(chǎng)生物物證中的應(yīng)用

吳 婷1牛青山1潘永峰2辛 陽(yáng)1

（1 中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧 沈陽(yáng) 110035；2 沈陽(yáng)市公安局刑警支隊(duì) 遼寧 沈陽(yáng) 110002）

通過(guò)采用Golden eye DNA ID System 20A試劑盒，對(duì)沈陽(yáng)市局2013年第二季度實(shí)際案例中現(xiàn)場(chǎng)所提取到的生物檢材如血濾紙、血棉簽、血紗布、煙蒂、吸管、硬質(zhì)糖果等進(jìn)行直接擴(kuò)增檢驗(yàn)，以探討DNA直接擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)實(shí)際案例中常見(jiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢材的有效性及可靠性。結(jié)果證明直接擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)能夠應(yīng)用于實(shí)際案例中常見(jiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢材的檢測(cè)。

直接擴(kuò)增法 Golden eye DNA ID System 20A 現(xiàn)場(chǎng)生物檢材

近年來(lái)，DNA鑒定以其特有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在公安機(jī)關(guān)案件偵破及法庭科學(xué)證據(jù)系統(tǒng)中占有越來(lái)越重要的位置。常規(guī)法醫(yī)物證實(shí)驗(yàn)室DNA檢驗(yàn)過(guò)程涉及到DNA提取、定量、PCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)等多個(gè)操作步驟，其中DNA提取過(guò)程就比較繁瑣，所以用常規(guī)方法完成DNA檢測(cè)過(guò)程需耗費(fèi)大量的人力、物力、財(cái)力及時(shí)間。目前，DNA數(shù)據(jù)庫(kù)逐漸成為跨時(shí)空精確打擊犯罪的“刑偵利器”，因此，迫切需要擴(kuò)大DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)的規(guī)模。這無(wú)疑對(duì)傳統(tǒng)的DNA檢驗(yàn)方式方法及流程提出了新的要求。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)實(shí)際案例中現(xiàn)場(chǎng)提取的檢材采用Golden eye DNA ID System 20A進(jìn)行免DNA提取步驟的直接擴(kuò)增研究，證明如果檢材沒(méi)有受到土壤等污染可以應(yīng)用直接擴(kuò)增法進(jìn)行DNA檢驗(yàn)，并應(yīng)用于實(shí)際工作中。該技術(shù)的應(yīng)用可極大地降低檢測(cè)成本，加快檢測(cè)速度，提高實(shí)驗(yàn)人員的工作效率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本

樣本為沈陽(yáng)市局2013年第二季度日常DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)所積累。從中隨機(jī)抽取樣本包括血濾紙7例、血棉簽27例、血紗布3例、煙蒂6例、吸管1例、硬質(zhì)糖果1例。

1.2 主要儀器和試劑

Golden eye DNA ID System 20A試劑盒；微量移液器(Gilson)；96孔板；9700型PCR擴(kuò)增儀(AB公司)；3130xl型遺傳分析儀(AB公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣本分組樣本分組見(jiàn)表1。

1.3.2 加樣方法

先將預(yù)先配好的擴(kuò)增試劑加入96孔板需要加樣本的凹內(nèi)。剪取不同樣本的檢材分別置于96孔板凹內(nèi)。同時(shí)，分別剪取A組（浸出液紅褐色）和B組（浸出液淡黃色）的血濾紙進(jìn)行不同濃度浸出液對(duì)免提取直接擴(kuò)增影響的觀察。取硬質(zhì)糖果半份放入潔凈提取盒置于冰箱冷凍30分鐘，后連盒取出，用20μl移液器吸取20μl預(yù)先配好的擴(kuò)增試劑，在硬質(zhì)糖果表面反復(fù)淬吸，后將淬吸液加入96孔板凹內(nèi)。在擴(kuò)增前用潔凈10μl槍頭將載體較大的棉絮，紗布分別挑出。等位基因標(biāo)準(zhǔn)分型物L(fēng)adder 2孔。

表1

1.3.3 擴(kuò)增條件

使用Golden eye DNA ID System 20A試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增體系為20μl：PCR反應(yīng)液(1×模板)；引物混合物(2×Primer，2×Mix)；去離子水（5×water)。進(jìn)行28次循環(huán)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，5min，循環(huán)0次；94℃，30s，60℃，1min，70℃，1min，28次循環(huán)；60℃，30min，15℃，forever。其余操作過(guò)程按照試劑和儀器說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

隨機(jī)抽取沈陽(yáng)市局2013年第二季度日常DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)所積累樣本56份，分別為不同載體的血跡、唾液斑。對(duì)其進(jìn)行直接擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)于以濾紙為載體的血跡樣本，A組浸出液為紅褐色，B組浸出液為淡黃色，此兩組對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 不同載體上生物檢材DNA“直擴(kuò)”檢測(cè)結(jié)果

表3 浸泡載體后PCR擴(kuò)增液的顏色對(duì)DNA“直擴(kuò)”的影響

3 討論

直接擴(kuò)增的方法在動(dòng)物、植物和微生物分子生物學(xué)中應(yīng)用較廣。該技術(shù)快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，非常適用于DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)，還有利于提高基層公安機(jī)關(guān)應(yīng)對(duì)一些大規(guī)模災(zāi)難性事故、群體性突發(fā)事件中DNA樣本檢驗(yàn)的能力。

首先，與傳統(tǒng)常規(guī)方法相比，直接擴(kuò)增技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：最突出的是省略了DNA提取步驟，僅通過(guò)擴(kuò)增和檢測(cè)兩個(gè)步驟即可獲得完整的STR分型結(jié)果，大大縮短了DNA檢驗(yàn)的時(shí)間，同時(shí)也節(jié)約了提取試劑和相關(guān)耗材；另外還避免了常規(guī)提取、擴(kuò)增過(guò)程中轉(zhuǎn)移樣品或試劑可能造成的污染。

其次，通過(guò)本次試驗(yàn)研究，直接擴(kuò)增檢驗(yàn)法雖然具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，但該方法還有一定的局限性。該方法適用于現(xiàn)場(chǎng)檢材量大的DNA快速分析，對(duì)于微量和特殊檢材，建議不采用該方法進(jìn)行檢驗(yàn)。一般相對(duì)潔凈的室內(nèi)現(xiàn)場(chǎng)血跡和唾液斑的提取“直擴(kuò)”比室外露天泥土灰塵較多的樣本成功率更高。例如以棉簽為載體的現(xiàn)場(chǎng)血跡沒(méi)能成功的幾個(gè)樣本均為室外泥沙磚石上轉(zhuǎn)移下來(lái)的血跡，為相對(duì)不潔凈的樣本，所含的泥沙等雜質(zhì)相對(duì)過(guò)多而抑制直接擴(kuò)增。另外，本實(shí)驗(yàn)中的吸管這一樣本就沒(méi)有檢測(cè)成功，分析原因可能是由于彩色塑料制品，長(zhǎng)時(shí)間浸泡在擴(kuò)增液中進(jìn)行直接擴(kuò)增，這其中有可能出現(xiàn)了抑制PCR反應(yīng)的化學(xué)成分。

最后，就本次試驗(yàn)提出幾點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)，第一，檢材量應(yīng)與擴(kuò)增體系相適應(yīng)，血痕的浸泡液以淡黃或淡紅色為宜。本次研究中，如結(jié)果所示：擴(kuò)增28個(gè)循環(huán)的1-7號(hào)濾紙血樣中沒(méi)有取得成功的1-4號(hào)樣本，均是由于檢材量過(guò)大，經(jīng)浸泡后擴(kuò)增液呈紅褐色，雖然樣本中DNA的濃度相對(duì)增加了，而抑制PCR反應(yīng)的血紅蛋白等物質(zhì)的含量也同樣增加，最終導(dǎo)致試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果不理想；第二，在擴(kuò)增前用潔凈10μl槍頭將載體較大的棉絮，紗布分別挑出，能獲得更好的檢測(cè)效果；第三，先加擴(kuò)增液再逐個(gè)加入待檢樣本，這樣能減少鄰近樣本的污染；第四，電泳前加樣應(yīng)小心操作，切不可吸入檢樣載體，以免堵塞電泳儀毛細(xì)管。參考文獻(xiàn)

1.趙興春，葉健.法庭DNA技術(shù)的發(fā)展及展望[J].刑事技術(shù)，1998，（5）

2.張建，姜成濤，趙興春，等.DNATyperTM15試劑盒直接擴(kuò)增檢驗(yàn)紙質(zhì)樣本的研究[J].刑事技術(shù)，2011，（4）

3.胡蘭，陳松，張國(guó)臣.國(guó)家法庭科學(xué)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)勢(shì)在必行[J].刑事技術(shù)，2003，（6）

4.李鈞敏，金則新.一種高效可直接用于PCR分析的土壤總微生物DNA抽提方法[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，17（11）