錢 潔, 朱長清, 呂利雄

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預(yù)混水楊酸鈉對大鼠急性百草枯中毒生存率的影響

錢 潔, 朱長清, 呂利雄*

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院急診與危重病科, 上海 200127）

探討預(yù)混水楊酸鈉（NaSAL）對急性百草枯（PQ）中毒大鼠生存率及肺損傷的影響。Wistar大鼠59只隨機分為正常對照組、NaSAL對照組、2組PQ組和2組PQ+NaSAL預(yù)混組。正常對照組（＝6）采用生理鹽水（NS）腹腔注射；NaSAL對照組（＝6）予腹腔NaSAL（300mg/kg）；2組PQ組用PQ[25mg/kg（＝11）或35mg/kg（＝12）]腹腔注射一次性染毒；2組預(yù)混組（＝12）：分別一次性給予PQ（25mg/kg）和NaSAL（200mg/kg）預(yù)混溶液，以及PQ（35mg/kg）和NaSAL（300mg/kg）預(yù)混溶液。觀察各組28d生存率及肺病理學(xué)改變。PQ25mg/kg組與PQ35mg/kg組生存率分別為36%和50%，2組預(yù)混組的生存率分別為33%和50%，PQ組與預(yù)混組各組間28d生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。病理學(xué)研究顯示PQ組急性期肺病變主要為彌漫性肺泡炎性損傷，表現(xiàn)為肺泡及肺泡間隔炎性細胞浸潤，肺泡腔內(nèi)出血、滲出，后期主要表現(xiàn)為纖維組織增生沉積。預(yù)混組的病理學(xué)改變與PQ組相比無明顯改善。從28d生存率和病理學(xué)角度觀察，預(yù)混NaSAL對急性PQ中毒大鼠的肺損傷無保護作用。PQ和NaSAL混合后對PQ的毒性無明顯影響。

百草枯; 水楊酸鈉; 肺損傷

百草枯（paraquat，PQ），作為高效價廉的觸殺性除草劑，是目前全球銷量最高的農(nóng)藥之一。根據(jù)對大鼠等動物測定的半數(shù)致死量數(shù)據(jù)，世界衛(wèi)生組織和美國環(huán)境保護署等權(quán)威機構(gòu)均把PQ歸為中等毒性，然而，經(jīng)口PQ急性中毒在人類表現(xiàn)為劇毒性質(zhì)，誤服一口20%原液即可因為多器官損害致死。經(jīng)過50余年的種種努力，PQ急性中毒仍缺乏有效解毒劑，是致死率最高的農(nóng)藥之一，引起國際社會嚴重關(guān)切[1,2]。

Dinis-Oliveira等[3]利用水楊酸鈉（sodium salicylate，NaSAL）治療PQ急性中毒的實驗給改善PQ中毒預(yù)后帶來突破性希望。研究顯示，PQ染毒大鼠經(jīng)NaSAL處理后30d全部存活，而對照染毒組大鼠在6d內(nèi)全部死亡（＜0.001）。NaSAL治療PQ中毒的成功，在他們的另一項研究中又通過賴氨匹林（一種水楊酸的衍生物）得到重復(fù)，30d生存率也高達100%[4]。進一步研究NaSAL與PQ之間存在直接理化反應(yīng)，兩者混合后顯示有新絡(luò)合物產(chǎn)生，并經(jīng)熔點、多種光譜分析方法證實[5]。新近該研究團隊用賴氨匹林對抗急性PQ中毒再次取得100%存活的優(yōu)異結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)PQ與賴氨匹林混合后不影響PQ的除草劑活性[6]。因此Dinis-Oliveira等推測，NaSAL與PQ之間存在的直接反應(yīng)，可能在NaSAL對抗PQ中毒中具有重要影響。

本實驗旨在對這一假說進行探討，以研究不同劑量NaSAL和PQ預(yù)混后，對大鼠的生存率及肺病理變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性Wistar大鼠59只，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心，標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)，10～12周齡，體質(zhì)量200～300g。主要試劑為PQ（1，1-二甲基-4，4-聯(lián)吡啶陽離子鹽，純度99%）、NaSAL（2-羥基苯甲酸單鈉鹽），購自Sigma公司。試劑以無菌生理鹽水溶解稀釋后用于腹腔注射。

1.2 方法

1.2.1 動物隨機分組（圖1） 正常對照組（＝6）：采用無菌生理鹽水腹腔注射。NaSAL對照組（＝6）：NaSAL（300mg/kg）腹腔注射。PQ 25mg/kg組（＝11）：PQ（25mg/kg），2h后予無菌生理鹽水。PQ 35mg/kg組（＝12）：PQ（35mg/kg），2h后予無菌生理鹽水。2個預(yù)混組（＝12）分別為：PQ（25mg/kg）＋NaSAL（200mg/kg）混合后給藥，2h后予無菌生理鹽水，以及PQ（35mg/kg）＋NaSAL（300mg/kg），混合后給藥，2h后予無菌生理鹽水。各組PQ、NaSAL均用無菌生理鹽水溶解后以1ml體積腹腔注射。

圖1 實驗大鼠分組給藥流程圖

Figure 1 Schematic representation of the administration protocols PQ: paraquat; NaSAL: sodium salicylate; NS: normal saline

1.2.2 標(biāo)本采集與制備 摘取急性期死亡大鼠的肺臟，并用無菌生理鹽水溶液即時配制3%的戊巴比妥鈉對28d存活大鼠進行腹腔麻醉后摘取肺臟，置于中性甲醛溶液固定，制備石蠟切片，行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色、Masson染色，光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

運用Kaplan-Meier法計算各組大鼠28d生存率，Log-rank法比較各組間生存率差異。＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生存率比較

實驗結(jié)果顯示，正常對照組和NaSAL對照組全部存活，生存率100%，PQ25mg/kg組與PQ35mg/kg組生存率分別為36%和50%，預(yù)混組A、預(yù)混組B的生存率分別為33%和50%，明顯低于正常對照組和NaSAL對照組（＜0.001），但PQ組與預(yù)混組生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05；圖2）。

2.2 動物一般狀況觀察

PQ組、預(yù)混組大鼠給藥后ld，即出現(xiàn)不同程度的毛發(fā)松散、瞇眼、口唇發(fā)紺、步態(tài)蹣跚、易捕捉等現(xiàn)象，中毒后2～5d癥狀最重，動物瀕死時出現(xiàn)深大呼吸、點頭樣呼吸或呼吸頻率加快，并出現(xiàn)明顯的全身發(fā)紺；存活至7d以上的大鼠上述癥狀開始逐漸減輕。正常對照組和NaSAL對照組未見明顯異常。

圖2 各組大鼠生存率曲線

Figure 2 Survival curves of rats in different groups PQ: paraquat; NaSAL: sodium salicylate

2.3 光鏡觀察

HE染色見正常對照組和NaSAL對照組大鼠的肺結(jié)構(gòu)正常，表現(xiàn)為肺泡壁無塌陷，肺泡內(nèi)無滲出液及細胞浸潤，無毛細血管擴張、充血等表現(xiàn)。PQ組急性期（第4天）病變主要為嚴重的肺泡炎性改變，表現(xiàn)為肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)大量炎性細胞浸潤，伴隨彌漫性肺出血、肺泡腔塌陷、肺泡壁增厚。同期預(yù)混組與PQ組相比無明顯病理差異。Masson染色可見，存活PQ組的肺組織病理表現(xiàn)為肺泡間質(zhì)增寬，有大量綠染的膠原纖維增生沉積，部分肺泡腔萎縮消失。預(yù)混組的肺病理切片表現(xiàn)類似（圖略），纖維化程度較PQ組無明顯減輕（圖3）。

3 討 論

為闡明NaSAL的解毒機制，Dinis-Oliveira等[5]想到了NaSAL與PQ有直接反應(yīng)的可能性，并注意到當(dāng)NaSAL溶液與PQ溶液兩者混合時，溶液立即不可逆地明顯變色，這種反應(yīng)在本實驗得到重復(fù)。Dinis-Oliveira等[5]進一步研究表明，PQ（陽離子）的吡啶環(huán)與水楊酸（陰離子）的芳香環(huán)之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移形成穩(wěn)定的新絡(luò)合物，降低PQ離子濃度，推測水楊酸使PQ毒性極大降低得益于此，這種現(xiàn)象已在多酚類與PQ相互作用中發(fā)現(xiàn)。

然而，本研究的初步結(jié)果并不支持這種推斷。PQ與NaSAL預(yù)混合后并不降低PQ對大鼠的急性毒性。結(jié)果顯示PQ與NaSAL預(yù)混合后28d生存率及肺病理損傷與PQ組無明顯差異，提示本組劑量配比預(yù)混后，兩者的直接化學(xué)反應(yīng)并沒有削弱PQ的毒性作用。

根據(jù)目前對PQ中毒的救治現(xiàn)狀，水楊酸對PQ急性毒性在硬終點生存率上顯著改善的報道顯然值得進一步探索。結(jié)合本研究結(jié)果，有以下方面值得進一步探討。

劑量與配比問題：Dinis-Oliveira等[3]在8周齡Wistar大鼠以PQ25mg/kg腹腔注射染毒，2h后腹腔注射NaSAL200mg/kg干預(yù)，對照組6只大鼠第6天即全部死亡，水楊酸鈉組30d仍全部存活。稍后Dinis-Oliveira等[4]又在8周齡Wistar大鼠以PQ125mg/kg經(jīng)胃染毒，2h后經(jīng)腹腔分別給與賴氨匹林100，200和400mg/kg治療，30d生存率染毒對照組為40%，賴氨匹林100mg/kg治療組為60%，賴氨匹林200mg/kg治療組為100%，賴氨匹林400mg/kg治療組為20%，初步提示賴氨匹林200mg/kg治療最佳，賴氨匹林400mg/kg治療組反而有加重現(xiàn)象。Dinis-Oliveira等[5]發(fā)現(xiàn)每一PQ離子可與1個、2個或4個水楊酸鹽離子結(jié)合，分別呈黃、桔黃或紅色改變，不同的配比混合對毒性的影響有待研究。在探索PQ與賴氨匹林混合的新劑型時，以PQ 125mg/kg經(jīng)胃染毒，分別混以配比1∶0.5，1∶1和1∶2克分子濃度的賴氨匹林，發(fā)現(xiàn)以1∶2配比（賴氨匹林316mg/kg）組生存率100%，而1∶1配比組也有加重現(xiàn)象[6]。問題在于傳統(tǒng)功效上400mg賴氨匹林等于222mg乙酰水楊酸（阿司匹林），這3項實驗的矛盾結(jié)果說明水楊酸合適劑量尚不清楚。本研究中水楊酸鈉200mg/kg和300mg/kg均未見明顯效果，俞愛青[7]用水楊酸鈉120mg/kg腹腔干預(yù)PQ 80mg/kg經(jīng)胃染毒，生存率也未見改善。宜按染毒途徑分層，分劑量細化設(shè)計方案，擴大每組樣本量，探索水楊酸的最佳劑量及給藥方式。

圖3 光鏡下正常大鼠及PQ組(25mg/kg)大鼠肺組織病理學(xué)改變

Figure 3 Histopathological changes of lungs in normal control and PQ (25mg/kg) groups

On day 4: interstitial and alveolar infiltration of inflammatory cell, widespread pulmonary hemorrhage, alveolar collapse and the enlargement of alveolar walls (hematoxylin-eosin ×200); on day 28: widened lung interstitial tissue, extensive fibrotic proliferation and deposition of collagen dyed green, obliteration of alveolar architecture (Masson ×200). The histological appearance in the pre-mixed PQ+NaSAL groups is similar to that in PQ groups

PQ急性毒性判定問題：PQ的急性毒性存在獨特的特點，傳統(tǒng)或最新的LD50測定方法均不適合PQ急性毒性的判定[1,8,9]。一是PQ有兩期毒性，二是動物種屬間以及同一種屬不同個體間對PQ毒性反應(yīng)差異極大，經(jīng)典的LD50或生存率測定方法使用小樣本動物可能嚴重影響結(jié)果判別。Dinis-Oliveira等[3]在8周齡雌Wistar大鼠以PQ25mg/kg腹腔注射染毒，染毒對照組6只大鼠第6天即全部死亡，而本組10周雄性Wistar大鼠以PQ25mg/kg或35mg/kg腹腔注射染毒，第6天死亡率僅36%和50%，28d終點死亡率與Dinis-Oliveira等結(jié)果自然也有不同。必須有足夠樣本量及足夠時間的觀測才能消除此種干擾。本組研究尚發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的動物人道終點處理方法也不適合PQ急性毒性測定，如許多動物雖然體質(zhì)量明顯下降（＞20%）或暫時喪失活動能力，但能挺住而順利存活[10]。

解毒機制問題：PQ的中毒機制尚不清楚。目前自由基和氧化壓力學(xué)說最為接受，但針對此通路所進行的各種干預(yù)均無明顯臨床療效。水楊酸具備抗氧化、抗炎和抗栓作用，Dinis-Oliveira等[3,11]實驗中也觀察到，Wistar大鼠NaSAL治療組與氧化應(yīng)激水平相關(guān)的一些指標(biāo)，如丙二醛較PQ組低，核因子-κB活性較PQ組弱，抑制PQ導(dǎo)致的肺組織凋亡。Huang等[12]對SD大鼠經(jīng)胃管PQ50mg/kg染毒后，2h后經(jīng)腹腔注射200mg/kg賴氨匹林治療，血清與肺組織中丙二醛水平減少，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶等水平增加。但因為有類似功能藥物并未有同樣治療效果，顯然不能單以此解釋Dinis-Oliveira等[3,4]實驗中水楊酸類在治療急性PQ中毒的對生存率顯著提高的作用機制，也難解釋本研究組織病理上未見明顯改善的結(jié)果。

水楊酸已應(yīng)用百年，阿司匹林成為醫(yī)藥史上3大經(jīng)典藥物之一，但水楊酸的作用復(fù)雜性可能遠超我們目前的認識[13]。近年來發(fā)現(xiàn)，水楊酸作為一種酚類激素，普遍存在于植物王國中，是植物面對病原入侵而啟動系統(tǒng)獲得性抗性的關(guān)鍵信號分子，也是植物面對熱、冷、紫外線等應(yīng)激時的保護調(diào)節(jié)劑[14]。已有研究表明，同時給予水楊酸能夠明顯降低PQ對植物的毒性，起效無須時間間隔，效果優(yōu)于提前給藥，再次提示兩者直接反應(yīng)在解毒中的重要性。而提前24h以上給藥仍有解毒活性，說明水楊酸降低PQ對植物的毒性尚有其他途徑。每個水楊酸可與2個羥自由基結(jié)合形成2，3-或2，5-二氫苯甲酸，不僅直接中和羥自由基濃度，2，3-二氫苯甲酸也是強力的鐵螯合劑，從而阻斷芬頓反應(yīng)停止羥自由基進一步產(chǎn)生。對水楊酸干預(yù)PQ急性毒性研究或許有助于對生命現(xiàn)象和水楊酸功能的新認識。

總之，鑒于目前急性PQ中毒的救治困境，根據(jù)水楊酸對PQ急性毒性在生存率上有顯著提高的初步結(jié)果等多項研究提示，以及對水楊酸功能的新發(fā)現(xiàn)結(jié)果，對以上問題針對性設(shè)計新方案，或許將可對PQ中毒救治帶來突破性進展。

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[9] World Health Organization. The WHO recommended classification ofpesticides by hazard and guidelines to classification: 2009 [EB/OL].http://www.who.int/ipcs/publications/pesticides_hazard/en/,2011-07-05/2012-02-01.

[10] OECD (2001) Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation[EB/OL]. http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html, 2011-07-07/2012-01-20.

[11] Dinis-Oliveira RJ, Sousa C, Remi?o F,. Sodium salicylate prevents paraquat-induced apoptosis in the rat lung[J]. Free Radic Biol Med, 2007, 43(1): 48?61.

[12] Huang WD, Wang JZ, Lu YQ,. Lysine acetylsalicylate ameliorates lung injury in rats acutely exposed to paraquat[J]. Chin Med J (Engl), 2011, 124(16): 2496?2501.

[13] Hawley SA, Fullerton MD, Ross FA,. The ancient drug salicylate directly activates AMP-activated protein kinase[J]. Science, 2012, 336(6083): 918?922.

[14] Rivas-San Vicente M, Plasencia J. Salicylic acid beyond defence: its role in plant growth and development[J]. J Exp Bot, 2011, 62(10): 3321?3338.

（編輯: 周宇紅）

Effect of premixed sodium salicylate on survival of rats after acute paraquat intoxication

QIAN Jie, ZHU Chang-Qing, LYU Li-Xiong*

(Department of Emergency and Critical Care, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200127, China)

To investigate the effect of premixed sodium salicylate(NaSAL) solution on the survival and lung injury in rats after acute paraquat(PQ) intoxication.A total of 59 Wistar rats were randomly divided into 6 groups as follows: normal control group(normal saline,＝6), NaSAL control group(＝6), 2 PQ groups and 2 pre-mixed PQ＋NaSAL groups. In PQ groups, rats were injected intraperitoneally with PQ of 25mg/kg (＝11) or 35mg/kg(＝12), and then, with 0.9% NaCl at 2h later. Pre-mixed PQ＋NaSAL groups were divided into pre-mixed 25mg/kg PQ and 200mg/kg NaSAL, (＝12), and pre-mixed 35mg/kg PQ and 300mg/kg NaSAL(＝12). In NaSAL control group, rats were administered with 0.9% NaCl solution, and then dosed with 300mg/kg NaSAL at 2h later. All groups were observed daily for survival rate and poisoning symptoms over a period of at least 28d. Lung tissues were collected from rats died in the acute stage and those survived over 28d, and then observed with HE and Masson staining for pathological changes.The survival rates were 36% and 50% respectively in the 25mg/kg PQ group and 35mg/kg PQ group, and 33% and 50% respectively in the two premixed groups respectively. No significant difference was observed in the 28-day survival rates between PQ groups and pre-mixed PQ＋NaSAL groups(＞0.05). Pathological observation showed that the rats exposed to PQ showed apparent lung changes at day 4 (acute stage), including inflammatory cells infiltration into alveoli and alveolar septum, alveolar hemorrhage and effusion at the acute stage, and proliferation and accumulation of fibrotic tissues at the late stage. There was no significant difference in pathological changes between the PQ groups and pre-mixed PQ＋NaSAL groups.Pre-mixed PQ with NaSAL shows no significant protective effect on rat lung injury induced by PQ intoxication. A pre-mixed PQ and NaSAL solution doesn’t counteract the toxic effect of PQ.

paraquat; sodium salicylate; lung injury

(08GWD16).

R595

A

10.3724/SP.J.1264.2013.00198

2013?03?20;

2013?07?05

上海市公共衛(wèi)生優(yōu)秀學(xué)科帶頭人培養(yǎng)計劃（08GWDl6）

呂利雄, E-mail: renjileo@163.com