景雁鳳,劉志敏,趙振江,鄭瑩瑩,展海軍
(河南工業(yè)大學 化學化工學院,河南 鄭州 450001)
辛硫磷是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛的一種有機磷農(nóng)藥,它可以抑制乙酰膽堿酯酶的活性,導致體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的大量蓄積,從而產(chǎn)生惡心、頭疼等中毒癥狀,嚴重的可以導致死亡[1],因此對其快速檢測顯得非常重要.傳統(tǒng)的檢測方法主要是色譜法,但這些方法樣品處理復雜,不適于進行現(xiàn)場檢測[2].基于電化學方法的傳感器,由于儀器易于微型化,為實現(xiàn)現(xiàn)場檢測分析提供了可能.
石墨烯是由單層碳原子密集排列成的二維蜂窩晶格結(jié)構(gòu)的一種碳材料,具有導電性能好、比表面積大和電子轉(zhuǎn)移速率快等優(yōu)點,目前已用作制備電化學傳感器的電極材料[3-5].但石墨烯的團聚限制了它的廣泛應(yīng)用.研究表明,石墨烯-氧化物復合材料具有良好的分散性和穩(wěn)定性[6],這些特性使其有望用于電化學傳感器的構(gòu)建并用于實際測定研究.基于此,本文構(gòu)建了一種基于石墨烯-ZnO(GR-ZnO)復合物的乙酰膽堿酯酶生物傳感器,并用于快速靈敏的檢測辛硫磷農(nóng)藥.
Prestige-21 傅立葉變換紅外光譜儀:日本島津公司;Hitachi-800 透射電子顯微鏡:日本日立公司;X-射線粉末衍射儀:XRD,D/max 2550,日本理學公司;CHI650C 電化學工作站:上海辰華儀器有限公司.采用三電極系統(tǒng):玻碳電極(GCE,Φ=3 mm)及復合物修飾電極為工作電極,飽和甘汞電極(SCE)為參比電極,鉑絲電極為對電極.
氯化乙酰膽堿(ATCl)和乙酰膽堿酯酶(AChE,C3389,236 U/mg)購于Sigma 公司;辛硫磷(純度≥99.99%)購自北京上立方聯(lián)合化工技術(shù)研究院;戊二醛(25%)由上海國藥集團提供;其他試劑均為分析純.試驗用水為二次蒸餾水.
首先采取文獻[7]中方法合成石墨氧化物(GO)和石墨烯(GR).
GR-ZnO 復合物采用改進的文獻方法合成[8].在200 mL 蒸餾水中首先加入0.2 g GO,超聲2 h,然后與100 mL 含有0.2 g Zn(NO3)2的溶液混合均勻,之后加入3 mL 氨水和0.2 mL 水合肼,120 ℃反應(yīng)4 h.產(chǎn)物用蒸餾水洗至中性,60 ℃干燥12 h,即制得GR-ZnO 復合物.
殼聚糖(CHI)首先溶解在1%的冰醋酸中制得0.5%g/mL 殼聚糖分散液.然后將適量GR-ZnO 復合物加入到上述分散液中,超聲分散后得到GRZnO/CHI 分散液.
GR-ZnO/CHI 分散液與0.5%戊二醛等體積混合,之后取5 μL 溶液滴加至電極表面,晾干后再滴加5 μL 的乙酰膽堿酯酶溶液,冰箱中干燥即得乙酰膽堿酶生物傳感器(AChE/ZnO-GR/CHI/GCE).
乙酰膽堿酯酶能夠催化底物氯化乙酰膽堿水解,催化活性受有機磷農(nóng)藥的抑制,導致水解產(chǎn)物硫代膽堿濃度減小,故電流減小.農(nóng)藥的濃度越大,電流減小的越顯著,即對酶的抑制率增加.抑制率可由下式計算[9]:
式中:I0為ATCl 在AChE/ZnO-GR/CHI/GCE 的響應(yīng)電流;I1是辛硫磷抑制后ATCl 在AChE/ZnO-GR/CHI/GCE 的響應(yīng)電流.
2.1.1 GR 的透射電鏡表征
采用透射電鏡研究了合成GR 的表面形貌,如圖1 所示,石墨烯呈現(xiàn)透明的,有小褶皺的薄片狀.
圖1 石墨烯的透射電鏡圖
2.1.2 GO、GR 和GR-ZnO 復合物的紅外光譜表征
圖2 中(a)為GO 的紅外圖譜,其中1 725 cm-1處的吸收峰為C=O 的伸縮振動吸收峰,1 389 cm-1對應(yīng)于C—O—H 的變形振動峰,1 063 cm-1處歸屬于C—O—C 伸縮振動吸收峰.GO 被水合肼還原后的紅外圖譜如圖2 中(b)所示,含氧官能團的吸收峰大大降低,說明GO 還原為GR 后,含氧基團基本上已被脫去.圖2 中(c)為GR-ZnO 復合物的紅外圖譜,與圖2 中(b)相比較,新增加的432 cm-1吸收峰為Zn-O 振動吸收峰[10].
圖2 GO(a)、GR(b)和GR-ZnO(c)復合物的紅外圖譜
2.1.3 GR 及GR-ZnO 的粉末衍射圖譜
GR,ZnO and GR-ZnO 的粉末衍射圖譜如圖3所示.GR 在25° 和44°出現(xiàn)衍射峰,與文獻報道一致[11].GR-ZnO 復合物的主要衍射峰與純ZnO 的衍射峰相同(JCPDS,65-3411),說明GR 的存在并沒有改變ZnO 的晶型.
圖3 GR,ZnO and GR-ZnO 的粉末衍射圖譜
2.2.1 不同電極的循環(huán)伏安圖
不同電極在5.0 mmol/L K3Fe(CN)6(含有0.1 mol/L KCl)溶液中的循環(huán)伏安曲線如圖4 所示.與裸玻碳電極(曲線a)相比,CHI 修飾后的電極峰電流(曲線b)稍增大,主要因為殼聚糖的導電性較差,使用GR-CHI 修飾電極后,峰電流增大(曲線c),這歸因于石墨烯較大的比表面積和良好的導電性.使用ZnO-GR/CHI 復合物修飾電極后,峰電流繼續(xù)增大(曲線d),這主要是由于石墨烯和氧化鋅的協(xié)同效應(yīng)引起的.由于石墨烯非凡的電子傳遞性,改善了電極的導電性,加快了電極上電子的交換速度,而且高導電率的氧化鋅的存在又能使石墨烯的分散性得到極大提高.
圖4 不同電極在5.0 mmol/L K3Fe(CN)(6含有0.1 mol/L KCl)溶液中的循環(huán)伏安圖
2.2.2 AChE/ZnO-GR/CHI/GCE 的電化學行為
圖5 為不同修飾電極在含有1.0 mmol/L ATCl的PBS(pH 7.5)中的循環(huán)伏安圖,可以看出,裸GCE 電極沒有峰(曲線a);而修飾電極AChE-CHI/GCE 有微弱的峰出現(xiàn)(曲線b),這個峰是AChE 催化底物ATCl 的水解產(chǎn)物巰基膽堿產(chǎn)生的氧化峰;電極經(jīng)過GR 修飾后,峰電流增加(曲線c),而經(jīng)過復合材料(ZnO-GR)修飾后的電極,其峰電流顯著增加,說明納米級氧化鋅和GR 具有較高的比表面積和電催化作用使基底和電極表面的電子轉(zhuǎn)移速度加快.同時也說明GR 和納米氧化鋅復合物具有很好的協(xié)同作用.
圖5 不同電極在pH 7.5 PBS 中含1.0 mmol/L的ATCl 的循環(huán)伏安圖
2.3.1 pH 的優(yōu)化
溶液的pH 值決定固定AChE 的生物活性,圖6 顯示了pH 值對1.0 mmol/L ATCl 在AChE/ZnOGR/CHI/GCE 上響應(yīng)電流的影響.可以看出,在pH 7.5 時峰電流值最大.考慮到檢測農(nóng)藥的靈敏度,本試驗選擇pH 值為7.5.
圖6 緩沖溶液的pH 對峰電流的影響
2.3.3 AChE 用量的優(yōu)化
酶的固定量影響生物傳感器的響應(yīng)信號.試驗在含有1.0 mmol/L ATCl(pH 7.5 PBS)中考察了固定不同量的酶對響應(yīng)信號的影響.如圖7 所示,當酶固定量達到50 U 時,響應(yīng)電流值達到最大,進一步增加酶用量峰電流卻減小.因此,試驗選擇酶的固定量為50 U.
圖7 酶濃度對傳感器響應(yīng)的影響
2.3.5 抑制時間的選擇
在農(nóng)藥分析中抑制時間是最有影響力的參數(shù)之一,圖8 顯示了抑制時間對生物傳感器響應(yīng)的影響.很顯然,隨著在辛硫磷溶液中抑制時間的增加,ATCl 在傳感器上的響應(yīng)電流逐漸減小.當抑制時間大于11 min,響應(yīng)電流值趨向一個穩(wěn)定值,表明辛硫磷和AChE 之間的結(jié)合位點達到平衡.因此抑制時間為11 min,從而使抑制率最大.
圖8 農(nóng)藥的抑制率與抑制時間的關(guān)系
在優(yōu)化的試驗條件下,AChE/ZnO-GR/CHI/GCE 在不同濃度的辛硫磷溶液中的差分脈沖伏安圖如圖9 所示.由圖9 可看出,隨著辛硫磷濃度的增加,電流逐漸減小,響應(yīng)電流的減少值與辛硫磷的濃度成正比關(guān)系,這樣就得到了用于分析的工作曲線.如圖10 所示,抑制率與辛硫磷濃度的對數(shù)值在1.0×10-11mol/L~1.0×10-6mol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性方程為:A(%)=109.56+8.66 lgc,相關(guān)系數(shù)為0.988 0,檢出限為3.4×10-12mol/L(S/N=3).
圖9 傳感器在不同濃度辛硫磷溶液中的差分脈沖伏安圖
稱取10 g 新鮮白菜菜葉,用研缽研碎,然后置于表面皿中,用微量注射器吸取100 μL 10-5mol/L辛硫磷農(nóng)藥標準溶液,將其噴撒于菜葉上,加蓋放置10 h,然后用丙酮萃取樣品中的辛硫磷,過濾并轉(zhuǎn)移至50 mL 的容量瓶中,定容搖勻,得到樣品溶液.樣品溶液進行加標回收率試驗,回收率的范圍在91.0%~110.0%之間.結(jié)果表明本試驗所用的檢測方法具有很高的準確性,可以用于實際樣品的直接分析.
圖10 辛硫磷的工作曲線圖
本文中提出了一種基于石墨烯-氧化鋅復合物固定乙酰膽堿酯酶的新型生物傳感器(AChE/ZnO-GR/CHI/GCE),并將其用于農(nóng)藥辛硫磷的測定.采用循環(huán)伏安法對不同修飾電極的電化學行為進行了表征,結(jié)果表明ZnO-GR/CHI 復合膜修飾于碳玻電極表面,能有效地提高玻碳電極的電化學響應(yīng)能力及保持乙酰膽堿酯酶的生物活性.由于乙酰膽堿酯酶能催化底物氯化乙酰膽堿的水解,水解產(chǎn)物巰基膽堿在電極上發(fā)生氧化產(chǎn)生電流,農(nóng)藥的加入會使該電流減小,產(chǎn)生抑制作用,抑制率與加入農(nóng)藥濃度的對數(shù)在一定范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,據(jù)此建立了測定辛硫磷的新方法.
[1]Li C Y,Wang C F,Ma Y,et al.A novel amperometric sensor and chromatographic detector for determination of parathion[J].Analytical Bioanalytical Chemistry,2005,381(2):1049-1055.
[2]Kandimalla V B,Ju H X.Binding of acetylcholinesterase to multiwall carbon nano -tube -cross-linked chitosan composite for flow-injection amperometric detection of an organophosphorous insecticide[J].Chemistry-A European Journal,2006,12(3):1074-1080.
[3]Wu P,Shao Q,Hu Y J,et al.Direct electrochemistry of glucose oxidase assembled on graphene and application to glucose detection[J].Electrochimica Acta,2010,55(28):8606-8614.
[4]Wei Q,Mao K X,Wu D,et al.A novel labelfree electrochemical immunosensor based on graphene and thionine nanocomposite[J].Sensors and Actuators B,2010,149(1):314-318.
[5]Wu J F,Xu M Q,Zhao G C.Graphene-based modified electrode for the direct electron transfer of Cytochrome c and biosensing[J].Electrochemistry Communication,2010,12(1):175-177.
[6]Paek S M,Yoo E J,Honma I.Enhanced cyclic performance and lithium storage capacity of SnO2/graphene nanoporous electrodes with three-dimensionally delaminated flexible structure[J].Nano Letters,2009,9(1):72-75.
[7]Li F H,Chai J,Yang H F,et al.Synthesis of Pt/ionic liquid/graphene nanocomposite and its simultaneous determination of ascorbic acid and dopamine[J].Talanta,2010,81(3):1063-1068.
[8]Xu T G,Zhang L W,Cheng H Y,et al.Significantly enhanced photocatalytic performance of ZnO via graphene hybridization and the mechanism study [J].Applied Catalysis B,2011,101(3-4):382-387.
[9]Ilaria P,Andrea C,Michele D C,et al.Determination of anticholineserase pesticides in real samples using a disposable biosensor[J].Analytica Chimica Acta,1997,354(1-3):179-187.
[10]Lepot N,Van Bael M K,Van den Rul H,et al.Synthesis of ZnO nanorods from aqueous so-lution[J].Material Letters,2007,61(13):2624-2627.
[11]Tang L H,Wang Y,Li Y M,et al.Preparation,structure and electrochemical properties of reduced graphene sheet films[J].Advanced Functional Materials,2009,19(17):2782-2789.