蔡莉，李榮，吳清清，吳婷妮

[摘要] 目的：觀察橙皮苷對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)及下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸的影響。方法：采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS）制備大鼠抑郁模型，60只雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、橙皮苷（40， 80， 160 mg·kg^-1）組及陽性藥氟西汀（10 mg·kg^-1）組。連續(xù)灌胃給藥3周，糖水偏愛實驗和強迫游泳實驗測定動物行為學(xué)，檢測血清皮質(zhì)酮（CORT）、腎上腺指數(shù)、下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRF） mRNA以及下丘腦室旁核糖皮質(zhì)激素受體（GR）蛋白，探討橙皮苷的抗抑郁作用及機制。結(jié)果：與模型組相比，橙皮苷（40， 80， 160 mg·kg^-1）治療組大鼠的糖水消耗量均明顯增加、強迫游泳不動時間有不同程度的減少。同時，橙皮苷能逆轉(zhuǎn)CUMS大鼠過高的血清CORT水平和腎上腺指數(shù)，并能抑制CUMS大鼠下丘腦CRF mRNA表達、上調(diào)室旁核GR蛋白表達。結(jié)論：橙皮苷能有效改善CUMS大鼠行為學(xué)，表現(xiàn)出抗抑郁作用，其機制可能與調(diào)節(jié)HPA軸的功能有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 橙皮苷；慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激；抗抑郁；下丘腦-垂體-腎上腺軸

抑郁癥是一種常見的危害人類身心健康的情感障礙性精神疾病，其患病率預(yù)計到2020年將躍升到第2位[1]，而從天然植物和中藥方劑中尋找安全、高效的抗抑郁藥物，已成為抗抑郁研究的重要方向之一[2-3]。橙皮苷為二氫黃酮類化合物，廣泛存在于柑桔屬植物如橙、柚、桔等，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗風(fēng)濕等藥理作用。研究證實，柑橘類水果的香味能降低強迫游泳實驗大鼠不動時間，該作用與調(diào)控5-HT和多巴胺的功能密切相關(guān)[4-5]；從柑橘類植物中分離得到的黃酮類化合物芹菜素，已被證實具有抗抑郁活性[6]，提示從柑橘屬植物中可能尋找到具有抗抑郁活性的天然化合物；此外，在具有抗抑郁作用的藥用植物Byrsonima crassifolia和中藥復(fù)方香蘇散（日本稱Koso-san）的有效成分中均含有橙皮苷[7-8]，但橙皮苷本身是否具有抗抑郁活性迄今未見報道。本研究采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress， CUMS）所致抑郁癥大鼠為實驗?zāi)Ｐ?，觀察橙皮苷長期給藥對CUMS大鼠行為學(xué)的影響，并探討橙皮苷對下丘腦-垂體-腎上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal， HPA）軸的調(diào)節(jié)作用，以闡明其可能的抗抑郁作用及內(nèi)在機制。

1 材料

1.1 動物 雄性SD大鼠，體重（180±20） g，安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號皖動準字01號。

1.2 藥物與試劑 橙皮苷（純度>98%）從陳皮中分離、純化；氟西?。ū本┲Z華制藥有限公司）；橙皮苷和氟西汀臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成相應(yīng)濃度。皮質(zhì)酮（corticosterone， CORT） ELISA試劑盒（RapidBio公司）；Trizol （Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（Applied Biosystems公司）；促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin release factor， CRF）引物（上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor， GR）兔抗多克隆抗體、SP-9000免疫組化試劑盒（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器 BP211D型電子天平（德國Sartarius公司）；MK3型全自動酶標儀（荷蘭雷勃公司）；ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；Nikon 80i型熒光顯微鏡（日本尼康公司）。

2 方法

2.1 動物分組與給藥方案 60只大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周，隨機分為正常組、CUMS模型組、橙皮苷低、中、高劑量組（40，80，160 mg·kg^-1）及陽性藥氟西汀組（10 mg·kg^-1），每組10只。于CUMS造模同時，各組動物灌胃給藥，每日1次，連續(xù)21 d，正常組及模型組給予同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉。

2.2 CUMS抑郁模型的建立 正常組每籠5只飼養(yǎng)，無任何刺激，其余組單籠飼養(yǎng)，按下列應(yīng)激程序制備慢性應(yīng)激抑郁模型[9]：5 min冷水游泳（8 ℃）、24 h斷食斷水、24 h傾斜鼠籠（45°）、30 min溫水游泳（30 ℃）、潮濕鼠籠過夜、擁擠鼠籠過夜、20 min水平搖晃，以上刺激隨機安排，每日1種，同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)，連續(xù)給予21 d應(yīng)激，造成大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型。

2.3 糖水偏愛實驗 大鼠于實驗前24 h被訓(xùn)練適應(yīng)含糖飲水，在禁食禁水12 h后進行測試，同時給予每只大鼠稱量好的1瓶2%蔗糖溶液和1瓶純水，4 h后測量糖水和純水消耗量，計算糖水偏愛即糖水消耗量占總液體消耗量的百分比。

2.4 強迫游泳實驗 強迫游泳實驗在慢性應(yīng)激3周后進行，將大鼠放于盛有高35 cm水（30 ℃）的透明圓柱形容器（高60 cm，直徑30 cm ）中被迫游泳。先進行15 min預(yù)游泳（預(yù)游泳作為應(yīng)激原對大鼠下次游泳時進入絕望狀態(tài)起誘導(dǎo)作用），24 h后再進行5 min正式游泳實驗，記錄大鼠5 min內(nèi)不動時間。每只大鼠單獨測試，按預(yù)先設(shè)計順序安排游泳測試，保證各組間測試時間無偏倚。

2.5 血清CORT水平和腎上腺指數(shù)的檢測 末次實驗后，稱量大鼠體重并斷頭處死，收集全血，靜置30 min后離心取上清，按ELISA試劑盒說明書檢測CORT水平。同時迅速分離并取出大鼠雙側(cè)腎上腺組織，稱重并計算腎上腺指數(shù)=腎上腺質(zhì)量（mg）/體重（g）×100%。

2.6 實時定量PCR（Q-PCR）檢測下丘腦CRF mRNA表達 分離大鼠下丘腦組織，Trizol法提取總RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄，Q-PCR采用SYBR Green染料法，反應(yīng)條件： 50 ℃ 2 min； 95 ℃ 10 min； 40個循環(huán)（95 ℃ 15 s； 64 ℃ 60 s）。引物序列：CRF sense 5′-CAGAACAACAGTGCGGGCTCA-3′， antisense 5′-AAGGCAGACAGGGCGACAGAG-3′； β-actin sense 5′-TTGCTGACAGGATGCAGAA-3′， antisense 5′-ACCAATCCACACAGAGTACTT-3′。目的基因mRNA的相對表達量根據(jù)2^-ΔΔCt的公式及方法進行換算。

2.7 免疫組化法檢測下丘腦室旁核GR的表達 按免疫組化試劑盒說明書進行，用PBS代替一抗作為陰性對照。具體如下：下丘腦組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，高壓抗原修復(fù)，3% H₂O₂滅活內(nèi)源性酶，山羊血清封閉20 min，滴加一抗后4 ℃過夜，滴加二抗后37 ℃孵育15 min，DAB顯色，脫水，透明，封片。采用南京大學(xué)捷達公司JD801型病理圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，每只大鼠選擇3張切片進行觀察，對每張切片的2個陽性表達區(qū)域分別計算所有染色的平均吸光度，以3張切片的均值進行半定量分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件進行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，組間比較采用One-Way ANOVA檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 橙皮苷對CUMS大鼠糖水消耗量的影響 分別在應(yīng)激第1天和第21天測定大鼠糖水偏愛，結(jié)果見表1。在第1天，各組大鼠的糖水偏好并無顯著性差異。在第21天，與正常組比較，經(jīng)長期慢性應(yīng)激后，模型組大鼠的糖水偏愛顯著性降低；與模型組相比，CUMS大鼠給予橙皮苷3周后，各劑量橙皮苷均能明顯提高CUMS大鼠低下的糖水偏愛水平；陽性對照藥氟西汀也能顯著提高CUMS大鼠的糖水偏愛。

3.2 橙皮苷對CUMS大鼠強迫游泳不動時間的影響 在強迫游泳實驗中，與正常組比較，長期慢性應(yīng)激能延長模型組大鼠強迫游泳不動時間，并具有顯著性差異。與模型組比較，橙皮苷（80，160 mg·kg^-1）灌胃給藥能顯著降低CUMS大鼠不動時間（P<0.01），氟西汀組大鼠的不動時間也明顯少于模型組大鼠，見圖1。

3.3 橙皮苷對CUMS大鼠CORT血清濃度的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清CORT含量明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，橙皮苷能劑量依賴性地降低CUMS大鼠血清中CORT的水平，陽性對照藥氟西汀也產(chǎn)生同樣的抑制作用，并且橙皮苷（80，160 mg·kg^-1）組和氟西汀組有顯著性差異，見表2。

3.4 橙皮苷對CUMS大鼠腎上腺指數(shù)的影響 與正常組相比，模型組大鼠的腎上腺指數(shù)顯著性升高。與模型組比較，橙皮苷（160 mg·kg^-1）對CUMS大鼠過高的腎上腺指數(shù)具有明顯的抑制作用，氟西汀也表現(xiàn)出顯著的抑制作用，見圖2。

3.5 橙皮苷對CUMS大鼠下丘腦CRF mRNA表達水平的影響 Q-PCR結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠下丘腦CRF mRNA表達明顯增多；與模型組比較，CUMS大鼠經(jīng)橙皮苷和氟西汀治療后，其下丘腦CRF mRNA表達水平有不同程度的降低，橙皮苷（80，160 mg·kg^-1） 組和氟西汀組有顯著性差異，見圖3。

3.6 橙皮苷對CUMS大鼠下丘腦室旁核GR蛋白表達的影響 免疫組化法檢測大鼠下丘腦室旁核GR蛋白表達情況，光鏡下可見GR陽性細胞的胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，各組切片可見不同數(shù)目和強度的GR染色陽性表達細胞。半定量分析結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠下丘腦室旁核GR蛋白表達顯著減少。與模型組相比，橙皮苷（80，160 mg·kg^-1）和氟西?。?0 mg·kg^-1）均可以顯著增加CUMS大鼠下丘腦室旁核GR蛋白的表達，見表3。

4 討論

抑郁癥患者的臨床癥狀表現(xiàn)為活動力下降、興趣喪失及食欲降低等。CUMS抑郁模型通過隨機給予不同的低強度應(yīng)激因子長期刺激動物，模擬人類慢性低水平應(yīng)激源導(dǎo)致的抑郁癥，該模型與抑郁癥患者的臨床表現(xiàn)有一定程度的相似性，被廣泛用于抗抑郁藥的活性篩選和發(fā)病機制的探討[10]。行為學(xué)實驗在評價藥物是否具有抗抑郁活性方面發(fā)揮重要作用。本研究表明，CUMS模型組大鼠的糖水偏愛明顯下降，糖水偏愛降低是衡量快感缺乏的有效客觀指標[11]，與抑郁癥患者興趣減低的癥狀相似，給予橙皮苷治療后能明顯增加CUMS大鼠的糖水偏愛。強迫游泳實驗通過觀察動物在不可逃避性應(yīng)激狀態(tài)下，因絕望致不動時間的改變反映藥物的抗抑郁效應(yīng)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)CUMS模型組大鼠強迫游泳的不動時間顯著增加，長期給予橙皮苷干預(yù)后，能減少CUMS大鼠的強迫游泳實驗不動時間。上述行為學(xué)研究結(jié)果表明，橙皮苷對CUMS抑郁模型大鼠具有一定的治療作用。

應(yīng)激刺激引起機體產(chǎn)生一系列相應(yīng)的生理和行為改變，即“應(yīng)激反應(yīng)”。應(yīng)激反應(yīng)最重要的特征是HPA軸活化及由此產(chǎn)生的糖皮質(zhì)激素（動物表現(xiàn)為CORT）大量釋放[13]。重復(fù)的HPA軸異常激活與抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，有研究表明抑郁癥患者血漿皮質(zhì)醇水平顯著升高、腦垂體和腎上腺明顯肥大[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，作為評價CUMS對HPA軸功能影響的重要指標，模型組大鼠血清CORT濃度顯著升高、腎上腺指數(shù)明顯上升，而CUMS大鼠經(jīng)橙皮苷長期給藥治療后，橙皮苷治療組大鼠的血清CORT和腎上腺指數(shù)均出現(xiàn)不同程度的翻轉(zhuǎn)，與CUMS大鼠抑郁行為的改善同步。

作為HPA軸活性調(diào)節(jié)的起點，CRF是HPA軸的關(guān)鍵中樞驅(qū)動力，在應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用[15]。來自下丘腦的CRF刺激腺垂體釋放促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotrophic hormone， ACTH），促使腎上腺分泌糖皮質(zhì)激素。生理情況下，過度升高的糖皮質(zhì)激素通過負反饋調(diào)節(jié)抑制ACTH，CRF的合成，維持糖皮質(zhì)激素相對穩(wěn)定和適度的應(yīng)激反應(yīng)。糖皮質(zhì)激素的負反饋調(diào)節(jié)由糖皮質(zhì)激素受體GR介導(dǎo)實現(xiàn)，GR結(jié)合配體后進入胞核，特異性結(jié)合CRF基因啟動子內(nèi)的負性糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件（nGRE），抑制下丘腦CRF的基因表達[16]。研究證實，抑郁癥患者下丘腦GR的活性和對配體的敏感性均降低，存在明顯的HPA軸負反饋調(diào)節(jié)機制受損現(xiàn)象，最終引起HPA軸超敏[17]。在本研究中，模型組大鼠下丘腦CRF mRNA表達顯著升高、下丘腦室旁核GR蛋白表達明顯下降，表明模型組大鼠存在CRF功能亢進、GR功能低下，橙皮苷灌胃給藥對CUMS大鼠下丘腦CRF mRNA及GR蛋白的異常表達均有一定的改善作用，表明橙皮苷可以通過增加下丘腦室旁核GR的表達，恢復(fù)糖皮質(zhì)激素的負反饋調(diào)節(jié)作用，下調(diào)異?；罨南虑鹉XCRF的功能，進而維持HPA軸的穩(wěn)態(tài)。

綜上所述，橙皮苷能夠有效改善CUMS模型大鼠的抑郁樣行為，具有抗抑郁作用，其可能機制為抑制CUMS大鼠HPA軸的亢進、調(diào)節(jié)HPA軸的功能狀態(tài)。

[參考文獻]

[1] 郭秋平， 高英， 李衛(wèi)民. 百合皂苷對抑郁模型大鼠HPA軸的影響[J]. 中國藥理學(xué)報， 2010， 26（5）： 699.

[2] Zhang Z J. Therapeutic effects of herbal extracts and constituents in animal models of psychiatric disorders[J]. Life Sci， 2004， 75（14）： 1659.

[3] Kawabata K， Kawai Y， Terao J. Suppressive effect of quercetin on acute stress-induced hypothalamic-pituitary-adrenal axis response in Wistar rats[J]. J Nutr Biochem， 2010， 21（5）： 374.

[4] Komori T， Fujiwara R， Tanida M， et al. Potential antidepressant effects of lemon odor in rats[J]. Eur Neuropsychopharmacol， 1995， 5（4）： 477.

[5] Komiya M， Takeuchi T， Harada E. Lemon oil vapor causes an anti-stress effect via modulating the 5-HT and DA activities in mice[J]. Behav Brain Res， 2006， 172（2）： 240.

[6] Yi L T， Li J M， Li Y C， et al. Antidepressant-like behavioral and neurochemical effects of the citrus-associated chemical apigenin[J]. Life Sci， 2008， 82（13/14）： 741.

[7] Herrera-Ruiz M， Zamilpa A， Gonzalez-Cortazar M， et al. Antidepressant effect and pharmacological evaluation of standardized extract of flavonoids from Byrsonima crassifolia[J]. Phytomedicine， 2011， 18（14）： 1255.

[8] Ito N， Nagai T， Yabe T， et al. Antidepressant-like activity of a Kampo （Japanese herbal） medicine， Koso-san （Xiang-Su-San）， and its mode of action via the hypothalamic-pituitary-adrenal axis[J]. Phytomedicine， 2006， 13（9/10）： 658.

[9] Chen X N， Meng Q Y， Bao A M， et al. The involvement of retinoic acid receptor-alpha in corticotropin-releasing hormone gene expression and affective disorders[J]. Biol Psychiatry， 2009， 66（9）： 832.

[10] Yang D， Li Q， Fang L， et al. Reduced neurogenesis and pre-synaptic dysfunction in the olfactory bulb of a rat model of depression[J]. Neuroscience， 2011， 192： 609.

[11] Guo J Y， Li C Y， Ruan Y P， et al. Chronic treatment with celecoxib reverses chronic unpredictable stress-induced depressive-like behavior via reducing cyclooxygenase-2 expression in rat brain[J]. Eur J Pharmacol， 2009， 612（1/3）： 54.

[12] Detke M J， Johnson J， Lucki I. Acute and chronic antidepressant drug treatment in the rat forced swimming test model of depression[J]. Exp Clin Psychopharmacol， 1997， 5（2）： 107.

[13] 劉麗琴， 羅艷， 張瑞睿， 等. 人參皂苷對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠行為學(xué)及HPA軸、BDNF的影響[J]. 中國中藥雜志， 2011， 36（10）： 1342.

[14] Swaab D F， Bao A M， Lucassen P J. The stress system in the human brain in depression and neurodegeneration[J]. Ageing Res Rev， 2005， 4（2）： 141.

[15] Binder E B， Nemeroff C B. The CRF system， stress， depression and anxiety-insights from human genetic studies[J]. Mol Psychiatry， 2010， 15（6）： 574.

[16] Bali B， Ferenczi S， Kovacs K J. Direct inhibitory effect of glucocorticoids on corticotrophin-releasing hormone gene expression in neurones of the paraventricular nucleus in rat hypothalamic organotypic cultures[J]. J Neuroendocrinol， 2008， 20（9）： 1045.

[17] Adcock I M， Barnes P J. Molecular mechanisms of corticosteroid resistance[J]. Chest， 2008， 134（2）： 394.

Effect of hesperidin on behavior and HPA axis of rat model of

chronic stress-induced depression

CAI Li1， LI Rong2*， WU Qing-qing2， WU Ting-ni2

（1. Department of Pathology， Anhui Medical University， Hefei 230032， China；

2. College of Pharmacy， Anhui Medical University， Hefei 230032， China）

[Abstract] Objective： To observe the effect of hesperidin on behavior and hypothalamic-pituitary-adrenal （HPA） axis of rat model of chronic stress-induced depression. Method： Chronic unpredictable mild stress （CUMS） was used to establish the rat depression model. Sixty male SD rats were divided randomly into six groups： the normal group， the model group， the hesperidin （40， 80， 160 mg·kg^-1） group and the positive fluoxetine （10 mg·kg^-1） group. They were orally administered with drugs for three weeks. The sucrose preference test and the forced swimming test （FST） were assayed to detect animal behavior. The levels of corticosterone （CORT） in serum， mRNA of corticotropin release factor （CRF） in hypothalamus as well as protein expression of glucocorticoid receptor （GR） in paraventricular nucleus （PVN） were determined to clarify the anti-depression effect and mechanism of hesperidin. Result： Compared with the model group， rats in the hesperidin （40， 80， 160 mg·kg^-1） treatment group showed significant increase in the sucrose consumption and decrease in the immobility time in FST to varying degrees. Meanwhile， the excessively high serum CORT and adrenal index of CUMS rats were reversed by treatment with hesperidin. In addition， hesperidin inhibited CRF mRNA expression in hypothalamus and up-regulated GR protein expression in PVN among CUMS rats. Conclusion： Hesperidin could effectively improve the behavior of CUMS rats and show the anti-depression effet. Its mechanisms may be related to the function of regulating HPA axis.

[Key words] hesperidin； chronic unpredictable mild stress； antidepressant； hypothalamic-pituitary-adrenal axis

doi：10.4268/cjcmm20130217

[責(zé)任編輯 張寧寧]