劉洪祥，曹曉云

(天津市藥品檢驗所，天津　300070)

《美國藥典》由美國藥典委員會編輯出版[1]，是對藥品質量標準和檢定方法的技術規(guī)定[2]，也是藥品生產(chǎn)、使用、管理、檢驗的法律依據(jù)[3，4]。隨著中國加入WTO后,藥品的原料及各種制劑的進、出口量逐年迅猛增加，在進口藥品注冊和進口藥品質量復核的檢驗標準及方法中均需參照進、出口國的藥典[5，6]?！睹绹幍洹?5版附錄“<62>非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法” 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查中包含定量試驗和定性試驗，均需經(jīng)預培養(yǎng)使藥品中污染的微生物復蘇，且要求預培養(yǎng)對污染微生物只復蘇但不增殖，否則直接影響進一步的定量試驗結果；腸道增菌肉湯的選擇性增菌情況對定量試驗和定性試驗兩部分均有著重要的意義。因此，本文針對這兩個問題做了初步的探索，以期為該方面的藥檢工作提供基礎性的參考意見。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種大腸埃希菌Escherichia coli [CMCC(B) 44 102]，銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa [CMCC(B)10 104]，沙門菌Salmonella group[CMCC(B) 50 094] ，阪崎腸桿菌Enterobacter sakazakii [ATCC(B) 51 329] ，天津市藥品檢驗所抗生素室保藏菌種。

1.1.2培養(yǎng)基① pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(北京三藥科技開發(fā)公司，批號120327)；②胰酪大豆胨肉湯(1號國外廠家、2號國內(nèi)A廠家、3號國內(nèi)B廠家、4號國內(nèi)C廠家、5號為按標準處方自制)；③腸道菌增菌肉湯(1號國外廠家、2號國內(nèi)A廠家)。

1.1.3主要設備儀器30%外排生物安全柜 Heal Force HFsafe-1200 (力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；壓力蒸汽滅菌器SANYO MLS-3780型 (日本三洋公司)；隔水培養(yǎng)箱 GNP-9270型 (上海精宏試驗設備有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱 Thermo SCIENTIFIC 146E (美國熱電公司)。

1.2方法

1.2.1菌懸液的制備按《美國藥典》35版附錄“<62>非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法”制得原菌懸液，用pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液以10倍稀釋法制得每1 ml菌數(shù)約≤100 cfu的懸液，涉及特殊菌數(shù)時將會在具體試驗中標注。

1.2.2菌落計數(shù)取適量菌懸液，采用營養(yǎng)瓊脂平皿傾注法試驗。

1.2.3供試液的制備按《美國藥典》35版附錄“<61>非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)”，取10 g供試品至250 ml無菌三角瓶中，加胰酪大豆胨肉湯稀釋至100 ml，制成1∶10供試液。

1.2.4增殖率與復蘇率增殖率(%)=[(預培養(yǎng)后菌數(shù)-加入菌數(shù))/加入菌數(shù)]×100%；復蘇率(%)=(預培養(yǎng)后菌數(shù)/加入菌數(shù))×100%。

1.2.5腸道增菌肉湯的變色試驗取1 ml菌數(shù)約≤100 cfu的菌懸液，加入10 ml 腸道增菌肉湯中，30 ℃靜止培養(yǎng)18、40和70 h，觀察變色反應并測定pH值。

2　結果與討論

2.1胰酪大豆胨肉湯的預培養(yǎng)情況考查《美國藥典》35版附錄“<62>非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法”規(guī)定預培養(yǎng)方法為，取不少于1 g的供試品，用胰酪大豆胨肉湯作為稀釋劑制成1∶10供試液，混勻，在20～25 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間應使供試品中的細菌充分恢復，但不增殖(一般2～5 h)。

2.1.1無供試液預培養(yǎng)情況取1號、2號、3號、4號和5號胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基各9 ml，分別加入1 ml菌數(shù)約≤100 cfu的大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌和沙門菌四種菌的菌懸液，于20 ℃和25 ℃靜止培養(yǎng)2 h，見表1。

表1結果表明，經(jīng)2 h預培養(yǎng)，5種胰酪大豆胨肉湯對各試驗菌均有不同程度的增殖作用。高限培養(yǎng)溫度25 ℃時，增殖率為34.0%～233.3%；低限溫度20 ℃時，增殖率為1.1%～159.3%； 25 ℃的增菌率明顯高于20 ℃。在低限溫度20 ℃時，培養(yǎng)最短時間2 h，5種不同來源培養(yǎng)基中最低增殖率為1.1%，而非不增殖。

表1　不同胰酪大豆胨肉湯對四種耐膽鹽革蘭陰性菌的預培養(yǎng)結果

2.1.2含供試液情況下預培養(yǎng)情況在供試液中人工污染大腸埃希菌，以模擬實際檢驗時受損污染菌的復蘇與增殖情況。試驗采用1號培養(yǎng)基，人工污染大腸埃希菌，于25 ℃靜止培養(yǎng)5 h，每0.5 h計數(shù)1次。

取百日咳糖漿和止咳顆粒兩種供試品試驗，結果見表2。百日咳糖漿無抑菌作用，每100 ml的1∶10供試液中污染47 cfu時，在2 h開始增殖，每100 ml的1∶10供試液中污染320 cfu時，從0.5 h就發(fā)現(xiàn)增殖，至5 h增殖率分別為4368%和3119%；止咳顆粒有一定的抑菌作用，每100 ml的1∶10供試液中污染47 cfu時，預培養(yǎng)4.5 h未見增殖，5 h時增殖至100 cfu，增殖率為113%；污染320 cfu時，3.5 h菌落計數(shù)結果為100 cfu，復蘇率31%，至5 h增殖率為88%。上述結果表明，在胰酪大豆胨肉湯中人工污染微生物經(jīng)2～5 h預培養(yǎng)，不能完全保證充分恢復但不增殖，在有一定抑菌作用的止咳顆粒樣品存在的情況下，5 h増殖率能達到88%，影響定量測定結果。

表2　胰蛋白胨大豆肉湯對樣品預培養(yǎng)情況

2.2腸道菌增菌肉湯的變色指示能力探討取相當于1 g供試品量的預培養(yǎng)物接種至腸道菌增菌肉湯，增菌后劃線于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，進行定性試驗。取相當于0.1、0.01和0.001 g供試品量的預培養(yǎng)物或預培養(yǎng)物稀釋液接種至腸道菌增菌肉湯，增菌后劃線于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上，通過最可能數(shù)法得出定量試驗結果。

腸道菌增菌肉湯增菌液，以及該培養(yǎng)基適用性檢查中促生長能力試驗結果中，均發(fā)現(xiàn)了不同來源培養(yǎng)基顯示不同顏色，《美國藥典》35版附錄僅提及促生長能力，并未提及顏色指示能力，因此本試驗進行了相關研究。

2.2.1不同培養(yǎng)基的變色情況本試驗采用大腸埃希菌進行，圖1為1號培養(yǎng)基在18、40和70 h的顏色變化情況，由綠色逐漸變?yōu)辄S。圖2為2號培養(yǎng)基在18、40和70 h的顏色變化情況，顏色由藍綠色變?yōu)闇\綠色。腸道菌增菌肉湯培養(yǎng)基的配方中，含有亮綠成分，其作為選擇性抑制劑，抑制革蘭陽性菌生長，而使腸桿菌科及其他革蘭陰性菌呈優(yōu)勢生長，亮綠顏色變化范圍為pH 0.0(黃)～2.6(綠)，具有弱變色指示能力。表3中1號和2號兩種培養(yǎng)基pH測定結果，不在亮綠顏色變化范圍pH 0.0(黃)～2.6(綠)，符合溴麝香草酚藍的變色范圍pH 6.0(黃)～7.6(藍)，1號培養(yǎng)基(進口)的明顯顏色變化有可能是在標準處方中添加了溴麝香草酚藍。

表3　腸道增菌肉湯中大腸埃希菌(61 cfu)增殖后的pH變化情況

大腸埃希菌18 h大腸埃希菌40 h大腸埃希菌70 h

圖11號培養(yǎng)基顏色變化情況

大腸埃希菌18 h大腸埃希菌40 h大腸埃希菌70 h

圖22號培養(yǎng)基顏色變化情況

2.2.2不同培養(yǎng)基的未變色情況為了進一步分析腸道增菌肉湯變色或未變色可能的原因，分別接種銅綠假單胞菌至1號和2號培養(yǎng)基中觀察pH值和顏色變化。圖3和圖4分別為1號和2號兩種培養(yǎng)基在18、40和70 h的顏色情況，培養(yǎng)前后培養(yǎng)基顏色均未變色。1號和2號兩種培養(yǎng)基pH測定結果，見表4，銅綠假單胞菌在該培養(yǎng)基培養(yǎng)的生長過程中未引起pH值的變化。

表4　腸道增菌肉湯中銅綠假單胞菌 (30 cfu)增殖后的pH變化情況

銅綠假單胞菌18 h銅綠假單胞菌40 h銅綠假單胞菌70 h

圖31號培養(yǎng)基的顏色變化情況

銅綠假單胞菌18 h 銅綠假單胞菌40 h 銅綠假單胞菌70 h

圖42號培養(yǎng)基的顏色變化情況

3　結論

通過對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、阪崎腸桿菌和沙門菌在不同廠家生產(chǎn)的胰酪大豆胨肉湯中預培養(yǎng)情況的分析，發(fā)現(xiàn)《美國藥典》35版附錄“<62>非無菌產(chǎn)品微生物檢查：控制菌檢查法”中“耐膽鹽革蘭陰性菌”項下的“供試液制備和預培養(yǎng)”中提及“培養(yǎng)時間應使供試品中的細菌充分恢復但不增殖(一般2～5 h)”，在實際檢驗工作中無法準確控制，菌體基本都會出現(xiàn)增殖的現(xiàn)象，這會對定量試驗結果造成一定的影響。因此，建議根據(jù)實際情況，采用不同的胰酪大豆胨肉湯預培養(yǎng)條件，盡量減少菌體增殖、降低試驗的偏差。此外，對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌在不同廠家的腸道菌增菌肉湯中增菌所引起的變色研究結果表明，耐膽鹽革蘭陰性菌包含細菌種類繁多、產(chǎn)酸能力有差異、不同菌株顏色變化不一致，該培養(yǎng)基顏色指示特性顯然不是專屬性指標，無論顏色變化與否都需進行下一步紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板劃線試驗確認。同《美國藥典》35版附錄所述一致,《美國藥典》附錄中未提及該培養(yǎng)基顏色指示能力。

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