楊淑芳，李　爽，王中玲，李真真，傅　晟，

(1.天津經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)衛(wèi)生防病站，天津　300457；　2.天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津　300457)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)，最早發(fā)現(xiàn)于1989年[1]，是引起慢性肝炎的主要病原體之一。目前全世界約有1.7億HCV感染者，占全球總?cè)丝诘?%[2]。其中80%感染人群會逐漸發(fā)展為慢性丙型肝炎，20%的感染者會演變成肝硬化，1%～5%的人會演變?yōu)楦渭毎3,4]。

丙型肝炎病毒為單股正鏈RNA病毒，其基因組為9.6 kb，可編碼一個含有3000個氨基酸的多聚酶前體，其通過細胞和病毒的蛋白酶進行翻譯后修飾等過程產(chǎn)生三個成熟的結構蛋白(蛋白核殼體的核心蛋白P22、包膜糖蛋白E1、E2)和六個非結構蛋白(NS2、NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B)[5]。HCV提供了許多潛在的小分子抑制靶點[6,7]。其中NS5B是HCV的RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，是HCV復制過程中的關鍵酶[8]。在HCV不同的基因型和亞型中，NS5B的相關活性位點非常保守，這為篩選針對不同基因型的HCV的藥物提供了重要的依據(jù)。人類細胞中不表達與NS5B RdRp功能相近的酶，使針對NS5B RdRp的抑制劑具有良好的選擇性[9]，因此對NS5B抑制劑的研究已經(jīng)成為研究HCV感染的主要努力方向。

以NS5B為靶點的抗病毒藥物分為核苷類抑制劑(nucleoside analogue inhibitor，NI)和非核苷類抑制劑( nonnucleoside analogue inhibitor，NNI)兩類。如今，已有多種NI和NNI進入臨床試驗，如Idenix公司的IDX-184、Roche公司的R7128、Boehringer Ingelheim 公司的BI207127、Vertex公司的VCH-759等。目前為止，大部分抑制劑的開發(fā)進行到體外酶活測定階段。本研究中篩選出的抑制劑與NS5B的復合體三維體結構將為進一步了解HCV NS5B蛋白分子抑制機制提供重要依據(jù)，也為HCV化合物藥物設計提供了依據(jù)。

1　實驗材料

1.1菌種與質(zhì)粒 大腸桿菌(E coli)DH5α、BL21(DE3)購自TransGen Biotech公司；HCV NS5BΔ21質(zhì)粒由天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院高通量分子藥物篩選中心提供；表達載體pET-21b質(zhì)粒購自Invitrogen公司。

2　實驗方法

2.1重組質(zhì)粒的構建及蛋白表達純化 以HCV NS5BΔ21基因為模板，使用Primer Premier 5.0軟件設計引物，5’端引物為CCATATGTCAATGTCCTACACATGGAC，3’端引物為CCTCGAGACGAGACAGGCTGT GATATA。擴增后的PCR產(chǎn)物和pET-21b載體使用FastDigest Nde I和FastDigest Xho I雙酶切后進行連接。

重組質(zhì)粒經(jīng)基因測序后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL 21(DE3)感受態(tài)細胞。挑取單克隆于5 ml含有100 μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃，220 r/min搖床培養(yǎng)8 h后按0.6%接種量接種到800 ml LB培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)至OD 600為0.6～0.8，將搖床降溫至16 ℃，加入160 μl 1 mol/L的IPTG溶液誘導后繼續(xù)培養(yǎng)16 h，離心收集菌體(4 ℃，5500 r/min)。采用Ni親和層析柱初步純化蛋白，MCAC-50(20 mmol/L Tris，pH 8.0；500 mmol/L NaCl；10%甘油；50 mmol/L咪唑)洗脫雜蛋白，MCAC-500(20 mmol/L Tris pH 8.0；500 mmol/L NaCl；10%甘油；500 mmol/L咪唑)洗脫NS5B融合蛋白。通過陽離子交換層析(Resource S)進一步純化蛋白，低鹽緩沖液(300 mmol/L NaCl，20 mmol/L MES，pH 6.5)平衡系統(tǒng)，高鹽緩沖液(700 mmol/L NaCl，20 mmol/L MES，pH 6.5)洗脫NS5B蛋白。最后將得到的NS5B蛋白溶于結晶緩沖液[600 mmol/L NaCl，10%(v/v)甘油，5 mmol/L DTT，10 mmol/L Tris，pH 7.5]中。

2.2晶體生長 現(xiàn)階段用于蛋白質(zhì)結晶的微量結晶技術主要有3種：氣相擴散法、液液擴散法以及透析法，氣相擴散法又分為坐滴法和懸滴法。本實驗使用懸滴法進行晶體的生長和優(yōu)化。蛋白質(zhì)結晶受蛋白質(zhì)自身性質(zhì)和所處環(huán)境的影響，任何一個細微的變化都會影響晶體的形成及質(zhì)量。本實驗對NS5B蛋白濃度(25、30、35和40 mg/ml)，pH值(5.0、6.0、7.0和8.0)，PEG 4000(15%、20%、25%和30%)及PEG 3350(15%、20%、25%和30%)，生長溫度(4、16 ℃、室溫)5個因素進行了梯度優(yōu)化。

為了得到穩(wěn)定的、質(zhì)量較好、數(shù)量較多的晶體，采取Terese Bergfors提出的種晶(seeding)[10]的方法對晶體進行進一步的優(yōu)化。在1.5 ml離心管中放入磁珠和200 μl晶體生長母液，用晶體環(huán)將剛長出的晶體撈出并轉(zhuǎn)移至離心管中，充分震蕩離心管使晶體破碎，然后用貓的胡須蘸取晶核，連續(xù)快速的滑過已經(jīng)平衡好的新的液滴。

2.3基于NS5B蛋白晶體結構的抑制劑篩選

2.3.1DMSO濃度的確定本實驗篩選的小分子片段庫中含有384種具有苗頭化合物性質(zhì)(“l(fā)ead-like”)的小分子化合物，都是非核苷類化合物?；衔锏南鄬Ψ肿淤|(zhì)量從100～200 kDa不等，平均相對分子質(zhì)量為160 kDa，用DMSO溶解，濃度為50 mmol/L。DMSO是助溶劑，由于浸泡過程中加入的化合物都溶解在95%的DMSO中，高濃度的DMSO本身對NS5B蛋白晶體有損壞作用，因此在進行浸泡工作之前需要測定NS5B蛋白晶體對DMSO的耐受程度。在盡可能保證晶體質(zhì)量的基礎上，使DMSO濃度達到最優(yōu)化，同時使浸泡時化合物的濃度最大。用95%的DMSO將晶體池液稀釋至濃度分別為4.75%、2.375%、1.1875%、0.95%、0.475%和0%。然后用尼龍晶體環(huán)將生長好的NS5B蛋白晶體取出，分別放入稀釋好的池液中，浸泡時間為2～24 h，每隔1 h觀察1次，至晶體出現(xiàn)裂痕。然后進行X射線衍射數(shù)據(jù)的收集與處理。

2.3.2抑制劑篩選蛋白質(zhì)與其底物、核苷酸或者小分子化合物結合后可以使其構象更加穩(wěn)定，晶體的生長更加容易，近年來已有大量利用共結晶技術成功篩選到晶體的報道[11]。本實驗中的晶體藥物浸泡是將蛋白質(zhì)分子與其底物混合在一起共同結晶的技術。該技術可以在原子水平上顯示蛋白質(zhì)分子與其底物復合物的結構，可以用來指導設計開發(fā)有針對性和高效性的抑制劑。

在“2.3.1”項下篩選出的合適DMSO濃度的基礎上，用晶體池液將化合物稀釋40倍，取2 μl 滴到玻片上，然后用尼龍晶體環(huán)將生長好的蛋白晶體從池液中撈出，加入含有化合物的池液中進行浸泡，蓋上玻片。每隔1 h觀察1次，直至晶體出現(xiàn)裂痕，然后進行X射線衍射數(shù)據(jù)的收集與處理。

3　實驗結果

3.1質(zhì)粒的構建及蛋白表達純化鑒定1.7 kb的NS5B目的基因和5.4 kb的pET-21 b表達載體連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，挑取陽性單克隆提取質(zhì)粒后用FastDiges○RNde I和 FastDigest○RXho I進行雙酶切鑒定。從圖1中可以看到5.4 kb的載體條帶和1.7 kb的目的基因條帶，確定了重組的成功。

采用Ni親和層析柱初步純化蛋白，然后通過Resource S離子交換層析進一步純化蛋白，可以得到大小為62 kDa的NS5B蛋白，蛋白的純度可到達95%。圖2顯示蛋白的純度已經(jīng)達到晶體生長需要的純度。

M：DNA分子量標準

3.2晶體生長結果經(jīng)過對NS5B蛋白結晶條件的優(yōu)化，確定了穩(wěn)定單晶的生長條件：30 mg/ml NS5B蛋白，20%(w/v)PEG 4000，10%(v/v)甘油，5 mmol/L DTT，50 mmol/L MES，pH 5.5。經(jīng)過種晶技術優(yōu)化，得到尺寸較大(通常為3 mm×1.5 mm×1 mm)，棱角分明的透明單晶，晶體的衍射分辨率達到1.9 ?。使用的防凍液為：25%乙二醇，30% PEG 4000(w/v)。采集NS5B蛋白晶體X 射線衍射數(shù)據(jù)，計算獲得蛋白的三維結構。圖3顯示的是優(yōu)化后單晶的形態(tài)。

M：蛋分子量標準　I：NS5B蛋白

圖3　NS5B單晶

3.3基于NS5B蛋白晶體結構的抑制劑篩選結果

3.3.1DMSO濃度的確定使用含有不同濃度的DMSO的池液進行晶體浸泡。從圖4(A)中可以看到含有0%的DMSO晶體池液對NS5B蛋白晶體的生長沒有影響；圖4(B)顯示晶體池液中DMSO濃度為2.375%時對NS5B蛋白晶體的生長幾乎沒有影響；圖4(C)顯示晶體池液中DMSO濃度為4.75%時，NS5B蛋白晶體明顯出現(xiàn)了裂痕，對晶體的生長影響較大。由此確定了進行晶體浸泡時的條件：用95%DMSO溶解的化合物稀釋40倍，使晶體池液中的DMSO濃度為2.375%，化合物濃度為5 mmol/L。

0%DMSO晶體泡藥1 h2.375%DMSO晶體泡藥1 h4.75%DMSO晶體泡藥1 h

圖4不同濃度DMSO對NS5B晶體的影響

3.3.2抑制劑篩選NS5B具有典型的“指掌”結構，主要由三部分組成，分別為拇指(thumb)區(qū)、手掌(palm)區(qū)和手指(fingers)區(qū)，其中“palm”區(qū)是核苷酸轉(zhuǎn)移反應的催化中心[12]。NS5B主要有五個非核苷類抑制劑的結合位點thumb-1、thumb-2、palm-1、palm-2和palm-3[13]。構成PalmⅠ結合位點的氨基酸有Phe 193、Pro 197、Arg 200、Ser 228、Gln 291、Asn 316、Gly 317、Asp 318、Cys 366、Ser 368、Met 414、Tyr 415、Gln 446、Ile 447、Tyr 448、Gly 449 及Ser 556。其氨基酸殘基Pro 197、Arg 200、Cys 366、Ser 368、Leu 384、Met 414、Tyr 415和Tyr 448，可以組成親脂口袋，作為抑制劑結合的部位。PalmⅡ結合位點的氨基酸有Phe193、Pro 197、Arg 200、Leu 204、Leu 314、Leu 360、3Ile 63、Val 321、Ser 365、Cys 366、Val 370、Me 414 t、Ty 415r和Tyr 448。

小分子片段庫中的非核苷類化合物與NS5B蛋白經(jīng)過共晶后得到復合物晶體，經(jīng)X射線衍射，比較收集處理的數(shù)據(jù)與NS5B蛋白母體單晶相同位置的數(shù)據(jù)，結果顯示有10種小分子化合物與NS5B蛋白有結合作用。這10中小分子化合物的結構式和分子量如表1所示。其中化合物1、4、9、10與化合物的相互作用較強。

經(jīng)過密度對比，化合物1結合在NS5B的Palm Ⅰ結合位點處，如圖5所示?；衔?的氨基氮與NS5B的Leu384的羧基氧，吡唑環(huán)上的氮與Leu384的氨基氮分別形成氫鍵，結合力較強。

化合物4結合與NS5B蛋白的結合位點在Palm Ⅰ的活性口袋中，如圖6所示，NS5B的Met414的甲基碳和化合物4的羰基氧形成氫鍵，相互作用較強。

化合物9結合在Palm Ⅱ位點，如圖7所示，化合物9的氰基與NS5B蛋白的Tyr415上氧形成氫鍵，嗎啉環(huán)上的氧原子與Cys366的硫原子形成共價鍵。

化合物10的六元環(huán)與NS5B的His502的咪唑環(huán)形成π-π共軛，阻礙NS5B形成二體化活性單位，從而達到抑制NS5B活性的目的。如圖8所示。

圖5　化合物1與NS5B蛋白的相互作用

編號 化合物名稱結構 分子量123456789103-甲基-5-氨基吡唑2-(三氟甲氧基)苯胺4-(三氟甲基)苯甲酸鄰氯苯甲酸甲酯2-吡啶羧酸2-氨基-6-氯苯腈2,3-二氫苯并[b]呋喃(5-苯基異惡唑-3-基)甲醇2-嗎啉代-2-苯乙腈3-苯基異惡唑-5-羧酸97.1203177.1244190.1195170.5943123.1105152.5835120.1502175.1861202.256189.457

圖6　化合物4與NS5B蛋白的相互作用

圖7　化合物9與NS5B蛋白的相互作用

圖8　化合物10與NS5B蛋白的相互作用

4　討論

本實驗將NS5B基因重組至pET-21b載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌進行表達并得到純度約為95%的NS5B蛋白。經(jīng)過優(yōu)化得到分辨率1.9 ?的NS5B晶體，在此基礎上使用晶體藥物浸泡的方法從小分子片段庫中篩選出10種小分子抑制劑，并根據(jù)NS5B與小分子抑制劑復合物的晶體結構，揭示了化合物與靶點的結合方式和作用位點，為開發(fā)HCV藥物提供了依據(jù)。

目前，在臨床試驗中主要使用聯(lián)合用藥的方法解決藥物對HCV 基因型的選擇性和丙型肝炎病毒對NS5B抑制劑的耐藥性。一是結合于不同變構位點的沒有交叉耐藥性的非核苷類抑制劑聯(lián)合用藥；二是標準療法聚乙二醇化α-干擾素與核苷類抑制劑或非核苷類抑制劑的聯(lián)合用藥；三是核苷類抑制劑與非核苷類抑制劑的聯(lián)合用藥。

到目前為止，臨床上仍然沒有有效的預防和治療HCV的藥物，采用的標準HCV治療方案是α-干擾素(interferon alfa,，IFN-α)或聚乙二醇化α-干擾素(pegylated interferon alpha, PEG-IFNα)和利巴韋林(ribavirin, RBV)聯(lián)合使用，但治療效率低，而且存在嚴重不良反應。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新型有效的抗HCV藥物。近年來，尋找HCV特定靶向抗病毒治療(specifically targeted antiviral therapy for HCV，STAT-C)藥物是抗HCV研究的重要方向[14]。

已有研究表明，依賴于晶體結構的小分子片段庫的篩選對分子質(zhì)量低的化合物庫的篩選常常能夠確定新的、有吸引力苗頭的化合物，這些有苗頭的化合物能夠進一步被優(yōu)化成為潛在的具有較好成藥性質(zhì)的先導化合物。本實驗采用的分子小片段庫就是具有苗頭化合物性質(zhì)的化合物集合，通過晶體藥物浸泡的方法篩出來的10種化合物中有4種化合物與NS5B蛋白有較強的結合作用，從原子水平上闡釋了化合物與NS5B蛋白相互作用的機理，而且這些化合物可作為苗頭化合物為開發(fā)新的HCV藥物提供有益線索。

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