葉迅 洪郁芝 徐新鵬

雷公藤內酯醇對小鼠腎小球足細胞裂孔隔膜核心蛋白表達干預作用的研究

葉迅 洪郁芝 徐新鵬

目的 觀察雷公藤內酯醇（TP）干預高糖環(huán)境培養(yǎng)的小鼠腎小球足細胞裂孔隔膜nephrin、podocin和CD2AP的表達，探討雷公藤治療糖尿病腎?。―N）蛋白尿的分子生物學機制。方法培養(yǎng)成熟的小鼠足細胞隨機分為對照組1、對照組2、高糖組和TP干預組，TP干預組進一步分為低劑量、中劑量和高劑量組。用不同濃度的TP（8、16和32ng/ml）干預高糖（25mmol/L的Glu）培養(yǎng)24h后的小鼠足細胞，用RT-PCR法檢測干預前后nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表達；用間接免疫熒光法檢測16ng/ml TP干預后nephrin和podocin蛋白的表達。結果（1）與對照組相比，高糖誘導的足細胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA表達均明顯減弱（均P＜0．01）。（2）TP顯著上調高糖誘導的足細胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表達（均P＜0．05）。（3）16ng/ml TP能明顯上調高糖對足細胞nephrin和podocin（均P＜0．05）蛋白表達的抑制。結論TP顯著上調高糖誘導的足細胞nephrin、podocin和CD2AP的表達，可能是其降低DN蛋白尿的機制之一。

雷公藤內酯醇 糖尿病腎病 腎小球足細胞裂孔隔膜 核心蛋白

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of triptolide(TP)on the expression of GPSD core proteins in mouse podocytes induced by high glucose．MethodsThe cultured mouse podocyte were randomly divided into control group1,control group2,high glucose group and TP treatment groups,which were further divided into low,middle and high dose subgroups．Podocyte exposed to 25 mmol/L glucose were treated with different doses of triptolide(8,16 and 32ng/ml)．The expressions of nephrin,podocin and CD2AP mRNA were examined by RT-PCR．The expressions of nephrin and podocin protein were detected by indirect immunoflorescence technique(IIFT)．ResultsCompared to control group,the expression of nephrin,podocin and CD2AP mRNA in high glucose group were significantly decreased (P＜0．05 or P＜0．01)．Compared to high glucose group,the expression of nephrin,podocin and CD2AP mRNA were significantly up-regulated(P＜0．05)in 3 TP-treatment groups,and the expression was highest in middle dose group(P＜0．05)．IIFT demonstrated that the inhibited expression of nephrin and podocin by high-glucose was significantly up-regulated in the middle dose group．ConclusionThe expressions of nephrin,podocin and CD2AP in the mouse podocyte are inhibited in high glucose condition．These core proteins inhibited in high glucose can be significantly up-regulated by triptolide,indicating that it may attenuate the proteinuria in diabetic hephropathy．

蛋白尿不但是糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy, DN）的臨床特征，更是導致其惡性進展的重要因素。新近的研究發(fā)現(xiàn)，腎小球足細胞裂孔隔膜（glomerular podocyte slit diaphragm，GPSD）上的多個核心蛋白，如nephrin，podocin和CD2AP表達的異常是導致包括DN的多種慢性腎病蛋白尿形成的主要原因[1]。近年來，雷公藤治療非DN和DN相關性蛋白尿的作用已被臨床證實[2-3]，但其降低蛋白尿的機制是否與影響GPSD核心蛋白表達有關，目前尚無文獻報道。本研究通過觀察雷公藤內酯醇（Triptolide，TP）干預高糖環(huán)境培養(yǎng)的小鼠足細胞nephrin、podocin和CD2AP的表達，旨在進一步闡明雷公藤治療DN蛋白尿的分子生物學機制。

1 材料和方法

1.1 小鼠足細胞的復蘇、凍存與傳代 復蘇-196℃液氮罐凍存的小鼠足細胞（由英國倫敦大學國王學院Guy’s醫(yī)院贈送），0.25%胰蛋白酶液1ml，室溫下消化，細胞變圓、細胞間隙增寬時，終止消化，置33℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，待細胞長至80%～90%融合時再傳代培養(yǎng)。

1.2 小鼠足細胞培養(yǎng) 將復蘇的小鼠足細胞轉入含有5ml 10%FCS1640培養(yǎng)液的50ml塑料培養(yǎng)瓶，每瓶加入50U小鼠γ-干擾素/mlRPMI1640培養(yǎng)基。置33℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育，細胞增殖傳代后，轉移入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱（培養(yǎng)基不變不含γ-干擾素）分化成熟。

1.3 實驗分組和培養(yǎng) 將分化成熟的“樹枝狀”足細胞傳代至30瓶，如下分6組，每組5瓶細胞：對照組1（CG1組）：10%FCS RPMI1640培養(yǎng)基；對照組2（CG2組）：5mmol/L Glu，10%FCS RPMI1640培養(yǎng)基；高糖組（HG組）：25mmol/L Glu，10%FCS RPMI1640培養(yǎng)基；低劑量TP組（LTP組）：8ng/ml TP，25mmol/L Glu，10%FCS RPMI1640培養(yǎng)基；中劑量TP組（MTP組）：16ng/ml TP，25mmol/L Glu，10%FCS RPMI1640培養(yǎng)基；高劑量TP組（HTP組）：32ng/ml TP，25mmol/L Glu，10%FCS RPMI1640培養(yǎng)基。6組在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24h后供實驗檢測指標。用不同濃度（8、16和32ng/ml）的TP干預高糖組培養(yǎng)24h后的小鼠足細胞。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后供RT-PCR使用。

1.4 RT-PCR半定量法檢測TP干預前后小鼠足細胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表達 Trizol試劑和氯仿抽提足細胞總RNA，微量核酸測量儀測定每個RNA樣品的濃度（單位為μg/ml）；逆轉錄酶M-MuLV催化下合成cDNA；在DNA自動擴增儀上進行PCR反應。25μl反應體系中含10×buffer 2.5μl，dNTP 0.5μl，引物正反義鏈各10pmol，TaqDNA聚合酶（購自上海博亞生物技術有限公司）1.5U，cDNA 1μl，加去離子水至終體積25μl，石蠟油封閉。PCR引物均根據(jù)已知的小鼠Nephrin、CD2AP、Podocin、GAPDH和GAPDH由PRIMER 5.0引物軟件設計（表1），由上海生物工程公司合成。

表1 PCR引物序列

擴增反應條件：Nephrin：95℃3min，進入循環(huán)，95℃30s、58℃30s、72℃60s，40個循環(huán)后，72℃10min；Podocin：95℃3min，進入循環(huán)，95℃30s、60℃30s、72℃60s，40個循環(huán)后，72℃10min；CD2AP：95℃3min，進入循環(huán)，95℃30s、57℃30s、72℃60s，45個循環(huán)后，72℃10min；GAPDH：95℃5min，進入循環(huán)，95℃30s、56℃30s、72℃30s，40個循環(huán)后，72℃10min。陰性對照以雙蒸水替代cDNA。各PCR產(chǎn)物與DNA Marke（r購自上海博亞生物技術有限公司）在1.7%瓊脂糖凝膠（含0.5mmol/L溴化乙錠），0.5%TBE液中電泳（100V，30min），用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)、Quantity-one軟件分析目的基因與內參的比值。

1.5 間接免疫熒光法檢測nephrin和podocin蛋白表達 選擇分化成熟的足細胞數(shù)瓶，用0.25%胰蛋白酶/ 0.0372%EDTA消化液消化離心，10%FCS RPMI培養(yǎng)液配成（104～105/ml）細胞懸液。傳代接種至六孔培養(yǎng)板進行細胞爬片。分為：對照組a（ 10%FCS RPMI1640培養(yǎng)基）、高糖組a（25mmol/L Glu，10%FCS RPMI1640培養(yǎng)基）；中劑量TP組a（16ng/ml TP，25mmol/L Glu，10% FCS RPMI1640培養(yǎng)基），每組3孔，孵育24h。室溫干燥20min，-20℃丙酮固定液固定玻片10min后風干。PBS漂洗、晾干，滴加一抗（1∶50稀釋）50μl，37℃孵育30～40min，陰性對照用PBS代替一抗。PBS漂洗3次，每次5min。滴加二抗（1∶200稀釋）50μl，室溫孵育30min。PBS漂洗3次，每次5min。熒光顯微鏡下觀察干預前后足細胞nephrin和podocin蛋白表達。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，測得計量數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 小鼠足細胞在不同溫度條件下形態(tài)學變化 在33℃條件下細胞呈現(xiàn)“鵝卵石狀”，胞體較小，在小鼠γ-干擾素誘導下不斷地增生傳代；在37℃條件下，經(jīng)1～2周時間，逐漸長出足突，胞體變大，足突與足突之間相互連接，足細胞逐漸分化成熟為“樹枝狀”。

2.2 TP對高糖刺激下足細胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA表達的影響 見表2、圖1～3。

由表2，圖1～3可見，與CG1組比較，CG2組、HG組和不同濃度TP組足細胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01）。其中以HG組nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表達最低（均P＜0.01）。與HG組比較，不同劑量TP組均上調nephrin、podocin和CD2AP mRNA表達（均P＜0.05），其中以MTP組干預效果最顯著，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

表2 各組nephrin,podocin,CD2AP mRNA的表達（n=5）

圖1 TP在高糖環(huán)境下對足細胞nephrin mRNA表達的影響

圖2 TP在高糖環(huán)境下對足細胞podocin mRNA表達的影響

圖3 TP在高糖環(huán)境下對足細胞CD2AP mRNA表達的影響

2.3 TP對高糖刺激下足細胞nephrin和podocin蛋白表達的影響 細胞免疫熒光檢測顯示，與對照組a比較，高糖組nephrin和podocin蛋白的表達顯著減弱。中等劑量TP組a 足細胞nephrin和podocin蛋白的表達與高糖組a相比均有一定程度提高，具體見圖4～5。

圖4 足細胞nephrin的表達（A：對照組a ；B：高糖組a ；C：中劑量TP組a，×400）

圖5 足細胞podocin的表達（A：對照組；B：高糖組；C：中劑量TP組，×400）

3 討論

DN是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，是導致終末期腎衰的主要病因。蛋白尿貫穿于DN整個病程，表現(xiàn)為早期的微量白蛋白尿，逐漸發(fā)展到難治性大量蛋白尿，最后出現(xiàn)腎功能不全。蛋白尿不僅與DN腎損傷程度密切相關，而且是直接導致腎功能惡化的重要危險因子。近年來研究發(fā)現(xiàn)，GPSD上的多個核心蛋白，如nephrin，podocin和CD2AP表達的異常是導致包括DN的多種慢性腎病蛋白尿形成的主要原因。

GPSD是血漿蛋白通過脈管系統(tǒng)的最后屏障，對于維持腎小球濾過屏障結構與功能完整性發(fā)揮關鍵作用。越來越多的研究表明在長期高血糖環(huán)境，DN腎小球“三高”對局部毛細血管袢機械牽張力，以及蛋白尿本身的慢性刺激下可通過血管緊張素Ⅱ在腎臟局部的濃聚，誘導氧化應激反應，激活細胞因子系統(tǒng)，尤其是TGF-β1和VEGF，造成GPSD上的核心蛋白表達下降，足細胞損傷、凋亡，足突融合，促進DN蛋白尿的發(fā)生與進展[5]。由于足細胞是一種高度分化的有限增殖細胞，一旦損傷后，病變不可逆，所以目前對DN防治的研究更進一步在于通過對足細胞保護從而減少蛋白尿的發(fā)生和進展。

在腎臟病領域中，雷公藤對各種免疫損傷性腎臟疾病所顯示的降低蛋白尿、保護腎功能的確切療效已得到一致公認[5-6]。雷公藤系衛(wèi)矛科雷公藤屬木質藤本植物，其藥用成分主要取自根部，作為祛風止痛中藥使用已有兩千多年歷史。

晚近研究表明，雷公藤還具有降低DN相關性蛋白尿的作用[4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤能明顯緩解DN患者蛋白尿，減少糖尿病動物模型腎小球系膜區(qū)細胞外基質（ECM）堆積，改善腎組織病理改變。以往研究表明，雷公藤降低蛋白尿的機制主要與保護和修復腎小球濾過屏障有關，但后者是否與雷公藤影響GPSD核心蛋白表達有關，目前尚無文獻報道。TP為二萜化合物，是雷公藤生物活性最強的單體成分。近期的研究發(fā)現(xiàn)，TP有效降低嘌呤霉素核苷酸誘導的大鼠腎損害的蛋白尿，該作用與改善足突融合，減少足細胞損傷標記物desmin的表達和恢復nephrin和podocin的表達及分布密切相關[7]。本研究通過觀察在單純的高糖環(huán)境培養(yǎng)下，TP干預小鼠足細胞GPSD核心蛋白nephrin、podocin和CD2AP的表達，來進一步闡明雷公藤治療DN蛋白尿的分子生物學機制。

本實驗觀察到，在5mmol/L的Glu環(huán)境下，足細胞GPSD核心蛋白nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表達即開始顯著下降，尤其當Glu濃度增高到25mmol/L時，表達下降最顯著。TP均可顯著上調高糖對nephrin、podocin和CD2AP mRNA表達的抑制，但其上調作用并非呈濃度依賴性，而以中等劑量16ng/ml TP上調作用最顯著，細胞免疫熒光亦支持上述高糖對足細胞GPSD核心蛋白nephrin和podocin表達的抑制現(xiàn)象，并且16ng/mlTP可有效上調后者的表達。

本研究的結果提示，體外不同Glu濃度培養(yǎng)的足細胞其nephrin、podocin和CD2AP等GPSD核心蛋白的表達下降，這可能與DN蛋白尿的發(fā)生發(fā)展有關。而雷公藤降低DN蛋白尿的機制可能與TP能顯著上調高糖誘導的足細胞nephrin、podocin和CD2AP的表達有關。然而，深入闡明GPSD核心蛋白表達與DN蛋白尿發(fā)生之間的關系，以及雷公藤保護足細胞，降低DN蛋白尿的作用機制有待于相關體內研究進一步證實。

[1]Braun N,Grone H J,Schena F P,et al．Immunological and non-immunological mechanisms of proteinuria[J]．Minerva Urol nefrol, 2009,61(4):385-396．

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Effect of triptolide on expression of GPSD core proteins in mouse podocytes induced by high-glucose

Triptolide DN GPSD Core protein

2012-10-19）

（本文編輯：沈昱平）

浙江省中醫(yī)藥管理局科研基金資助項目（2006C106）

310007 杭州市中醫(yī)院內分泌代謝科

洪郁芝，E-mail：hyzhcy@aliyun.com