余潔 趙海嵐 吳苗琴

NGF對(duì)LASIK及Epi-LASIK術(shù)后角膜中TrkA受體表達(dá)作用的研究

余潔 趙海嵐 吳苗琴

目的 觀察兔眼準(zhǔn)分子激光原位角膜磨鑲術(shù)（LASIK）及準(zhǔn)分子激光上皮瓣下角膜磨鑲術(shù)（Epi-LASIK）術(shù)后局部點(diǎn)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）后角膜組織中酪氨酸激酶受體A（TrkA）的表達(dá)情況，探索術(shù)后干眼癥的防治方法。方法將30只新西蘭純種兔，抽取15只30眼接受LASIK手術(shù)，余接受Epi-LASIK手術(shù)。術(shù)后每只兔子一眼滴NGF滴眼液，為實(shí)驗(yàn)眼，對(duì)側(cè)眼滴0．9%氯化鈉溶液，為對(duì)照眼。1周后進(jìn)行免疫組化分析，檢測(cè)角膜上皮細(xì)胞層以及角膜基質(zhì)層中TrkA的表達(dá)情況。結(jié)果觀察TrKA的表達(dá)，接受LASIK或Epi-LASIK手術(shù)后，滴用NGF滴眼液的眼均較對(duì)照眼強(qiáng)。LASIK組以及Epi-LASIK組滴用NGF眼兩者比較TrkA的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論滴用NGF的兔眼，其LASIK或Epi-LASIK術(shù)后TrkA受體表達(dá)均較高，可能有助于防治近視激光術(shù)后干眼癥。

神經(jīng)生長(zhǎng)因子 酪氨酸激酶受體A 準(zhǔn)分子激光原位角膜磨鑲術(shù) 準(zhǔn)分子激光上皮瓣下角膜磨鑲術(shù) 干眼癥

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the effect of nerve growth factor(NGF)on the expression of TrkA in cornea after LASIK or Epi-LASIK．MethodsSixty eyes of 30 New Zealand white rabbits underwent LASIK or Epi-LASIK procedures with 30 eyes in each group．One eye,randomly selected in each rabbit was treated with topical NGF for 1 week,while the contralateral eye was treated with normal saline as control．The expression of NGF receptor(TrkA)on cornea was detected by histoimmunochemistry．ResultsThe expression of TrkA on the cornea treated with the topical NGF after LASIK or Epi-LASIK was stronger than that of control group．There was no difference in expression of TrkA between LASIK and Epi-LASIK groups． Conclusion Topical treatment of NGF can up-regulate the expression of TrkA in the cornea of rabbits after LASIK or Epi-LASIK．

隨著近視眼角膜屈光手術(shù)的廣泛開展，手術(shù)后干眼癥問(wèn)題越來(lái)越受到重視。目前臨床上對(duì)干眼癥的治療主要局限在應(yīng)用人工淚液來(lái)緩解患者的干眼癥狀。由于人工淚液與正常淚液的成分相差甚遠(yuǎn)，人工淚液的使用一般只能起到緩解眼干癥狀的作用，而無(wú)明顯的治療效果。由于在近視激光術(shù)后所產(chǎn)生的干眼癥，很大程度上與手術(shù)中切斷了角膜的感覺(jué)神經(jīng)有關(guān)[1-4]，因此如果能盡快修復(fù)神經(jīng)的損傷，改善角膜上皮的營(yíng)養(yǎng)，可以很大程度上防止干眼癥的發(fā)生或縮短患者術(shù)后使用人工淚液的時(shí)間[5-6]。我們通過(guò)觀察兔眼準(zhǔn)分子激光原位角膜磨鑲術(shù)（laser in situ keratomileusis，LASIK）及準(zhǔn)分子激光上皮瓣下角膜磨鑲術(shù)（epipolis laser in situ keratomileusis，Epi-LASIK）術(shù)后局部點(diǎn)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）后角膜組織中酪氨酸激酶受體A（TrkA）表達(dá)的改變，旨在了解外源性NGF對(duì)LASIK及Epi-LASIK術(shù)后干眼癥可能的治療作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 LASIK動(dòng)物模型眼的制備 取眼部檢查正常的健康新西蘭大耳白兔30只（由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重2～3 kg，雌雄兼?zhèn)?，普通?jí)）。抽取15只30眼進(jìn)行LASIK手術(shù)為L(zhǎng)ASIK組，另15只30眼進(jìn)行Epi-LASIK手術(shù)為Epi-LASIK組。手術(shù)過(guò)程：用1%戊巴比妥鈉針注射麻醉（30mg/kg體重），麻醉起效后，用不透水塑料袋包裹動(dòng)物，暴露頭部，剪掉眼瞼周圍較長(zhǎng)睫毛，滴0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉2次。用無(wú)齒鑷和紋式鉗輕輕上提眼球至脫臼狀態(tài)，術(shù)中用紋式鉗在眼球后稍加固定（避免鉗夾視神經(jīng)），+2號(hào)負(fù)壓環(huán)（蘇州康明公司產(chǎn)品）固定環(huán)吸附眼球，Moria-M2角膜刀制作130μm厚角膜瓣（Epi-LASIK組制作110μm厚角膜瓣），掀開角膜瓣做激光切削（AllegrettoWave鷹視準(zhǔn)分子激光機(jī)，切削直徑6 mm，切削量20μm），BSS液沖洗，LASIK組，角膜瓣復(fù)位縫線固定，Epi-LASIK組角膜瓣去瓣。

1.2 神經(jīng)生長(zhǎng)因子滴眼液的配置與使用及分組 蘇肽生針劑（注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子，由舒泰神藥業(yè)有限公司惠贈(zèng)），生物活性≥15 000Au（30μg）/支，為透明澄清水溶液，磷酸鹽緩沖液調(diào)整pH值至7.3～7.5，過(guò)濾法除菌，分裝放入4℃冰箱中備用。自LASIK及Epi-LASIK術(shù)后第1天起，所有手術(shù)眼術(shù)后均點(diǎn)妥布霉素地塞米松滴眼液4次/d，抗炎及預(yù)防性抗感染治療，另外每只兔子右眼術(shù)后點(diǎn)用0.9%氯化鈉溶液配置的100μg/ml的NGF，4次/d，每次50μl，連續(xù)滴1周，對(duì)側(cè)眼滴用0.9%氯化鈉溶液，4次/d，每次50μl，連續(xù)滴1周。滴用NGF的兔眼為實(shí)驗(yàn)眼，滴用0.9%氯化鈉溶液的兔眼為對(duì)照眼。

1.3 標(biāo)本采集 在動(dòng)物模型建立后及滴眼液使用過(guò)程中常規(guī)每日進(jìn)行裂隙燈檢查。1周后，兔子均被靜脈注射空氣猝死，并立即在無(wú)菌條件下摘除眼球，剪除球結(jié)膜、筋膜、眼外肌、脂肪等結(jié)締組織，剪除視神經(jīng)。

1.4 免疫組化檢測(cè) 將眼球組織進(jìn)行脫水及石蠟包埋，進(jìn)行免疫組化分析，檢測(cè)角膜上皮細(xì)胞層以及角膜基質(zhì)層中NGF高親和力受體（TrkA）的表達(dá)情況。常規(guī)石蠟切片、二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，高壓修復(fù)抗原3min、3%H2O2孵育10min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、10%正常羊血清室溫下封閉15min、滴加TrkA抗體（R&D Systems），4℃過(guò)夜，滴加生物素化二抗室溫孵育20min，PBS洗5min×3次，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素室溫孵育20min，PBS洗5min×3次，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。一抗工作濃度為1∶10，同時(shí)，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

每例角膜組織選一張切片，每張切片隨機(jī)選取角膜中央斷面區(qū)域角膜上皮細(xì)胞及其周圍約2cm×2cm大小（放大400倍）范圍，用免疫組織化學(xué)圖像分析軟件（Image-Pro Plus 6.0）檢測(cè)其平均吸光度值作為該區(qū)域的TrKA的相對(duì)含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，測(cè)得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后滴用眼水1周免疫組化角膜組織TrkA表達(dá) 顯微鏡下觀察15只接受LASIK手術(shù)的新西蘭兔子30只眼球的角膜切片組織，均可發(fā)現(xiàn)角膜上皮細(xì)胞的胞質(zhì)顯示為棕黃色，但顯色強(qiáng)弱不一。實(shí)驗(yàn)組的角膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)顯色均強(qiáng)于自身對(duì)照眼。顯微鏡下觀察15只接受EPI-LASIK手術(shù)的新西蘭兔子30只眼球的角膜切片組織，同樣可發(fā)現(xiàn)角膜上皮細(xì)胞的胞質(zhì)顯示為棕黃色，但顯色強(qiáng)弱不一。實(shí)驗(yàn)組的角膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)顯色均強(qiáng)于自身對(duì)照眼（圖1）。

圖1 免疫組化染色檢測(cè)各組新西蘭純種兔術(shù)后角膜上皮細(xì)胞TrkA的表達(dá)（A：LASIK實(shí)驗(yàn)眼；B：LASIK對(duì)照眼；C：Epi-LASIK實(shí)驗(yàn)眼；D：Epi-LASIK對(duì)照眼；×400）

2.2角膜組織中TrkA免疫組化法檢測(cè)平均吸光度值比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組實(shí)驗(yàn)眼和對(duì)照眼TrKA平均吸光度值比較

由表1可見(jiàn)，LASIK組術(shù)后實(shí)驗(yàn)眼平均吸光度值與其對(duì)照眼比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Epi-LASIK組術(shù)后實(shí)驗(yàn)眼平均吸光度值與其對(duì)照眼比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。LASIK組實(shí)驗(yàn)眼以及Epi-LASIK組實(shí)驗(yàn)眼比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

準(zhǔn)分子激光屈光手術(shù)近年來(lái)由于其有效性和安全性已被廣泛應(yīng)用，但其并發(fā)癥也引起了廣泛的重視。干眼癥是所有準(zhǔn)分子激光手術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥，也是造成術(shù)后患者不滿的常見(jiàn)原因。LASIK手術(shù)切斷了三叉神經(jīng)支配角膜的部分主干和分支，導(dǎo)致角膜的營(yíng)養(yǎng)和觸覺(jué)的異常。Epi-LASIK雖然不損傷角膜神經(jīng)的主干，但制作角膜上皮瓣后切斷了神經(jīng)末梢，隨后的激光切削進(jìn)一步損傷基質(zhì)層的神經(jīng)纖維，仍可導(dǎo)致術(shù)后干眼癥。

NGF作為人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)生長(zhǎng)因子，目前對(duì)其結(jié)構(gòu)功能以及作用機(jī)制有了較為清楚的了解，NGF具有保護(hù)效應(yīng)神經(jīng)元和促進(jìn)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)的作用。一般認(rèn)為神經(jīng)損傷后施萬(wàn)細(xì)胞合成的NGF先與其膜上的低親和力受體（主要是p75）結(jié)合，當(dāng)再生軸突長(zhǎng)入損傷遠(yuǎn)側(cè)段或靶組織與施萬(wàn)細(xì)胞接觸時(shí)，NGF從低親合力受體上脫落,轉(zhuǎn)而與再生軸突上的高親和力受體（主要是p140，TrkA）結(jié)合，NGF便由施萬(wàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到軸突，經(jīng)逆行運(yùn)輸至效應(yīng)神經(jīng)元胞體后，與受體特異性結(jié)合，通過(guò)控制Na+-K+泵活動(dòng)等復(fù)雜機(jī)制，保護(hù)軸突受損的神經(jīng)元存活，并促進(jìn)蛋白質(zhì)及微絲微管生物合成以利軸突再生。

目前對(duì)NGF在眼表組織中的表達(dá)情況已進(jìn)行了比較深入的研究。有研究表明在人類的角膜組織上皮細(xì)胞以及角膜基質(zhì)層中都可以檢測(cè)到NGF和相關(guān)受體TrkA的表達(dá)[7]，而國(guó)外已有一些研究表明，在PRK以及LASIK手術(shù)后短期內(nèi)淚液中的NGF濃度有比較明顯的上升[8]，說(shuō)明在近視激光術(shù)后角膜傷口的愈合過(guò)程中NGF起著一定的作用，并且發(fā)現(xiàn)對(duì)兔眼進(jìn)行LASIK術(shù)后使用NGF，可以提高角膜的敏感性[9]。對(duì)于一些實(shí)驗(yàn)性的角膜上皮細(xì)胞缺損和角膜潰瘍，NGF有促進(jìn)傷口修復(fù)的作用[10-11]，NGF能夠改善對(duì)于摘除動(dòng)物的第三眼瞼后造成的干眼癥[12]等。所有這些信息表明近視激光術(shù)后外源性NGF的使用，可能會(huì)起到阻止干眼癥發(fā)生的作用。

由于檢測(cè)角膜上皮細(xì)胞層TrkA的表達(dá)情況，可以間接得知神經(jīng)生長(zhǎng)的狀況。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察比較LASIK或Epi-LASIK術(shù)后滴用NGF和0.9%氯化鈉溶液的兔眼角膜上皮細(xì)胞層TrkA的表達(dá)情況，從而間接推斷角膜神經(jīng)的生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)證明：滴用濃度為100μg/mlNGF的兔眼，其LASIK或Epi-LASIK術(shù)后角膜中TrkA受體表達(dá)水平明顯較滴用0.9%氯化鈉溶液的兔眼高，間接證明滴用外源性NGF，促進(jìn)神經(jīng)再生，角膜的營(yíng)養(yǎng)提供得到保障，推測(cè)干眼癥狀有可能得到較快緩解，因此推測(cè)外源性NGF對(duì)LASIK及Epi-LASIK術(shù)后發(fā)生的干眼癥可能起到一定的治療作用。但LASIK術(shù)后以及Epi-LASIK術(shù)后皆滴用外源性NGF，兩者TrkA的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明兩種不同的手術(shù)方式術(shù)后滴用外源性NGF，對(duì)TrkA表達(dá)水平的影響相似。

[1] Nettune G R,Pflugfelder S C．Post-LASIK tear dysfunction and dysesthesia[J]．OculSurf,2010,8(3):135-145．

[2]Rosenfeld SI．Evaluation and management of post-LASIK dry eye syndrome[J]．Int Ophthalmol Clin,2010,50(3):191-199．

[3]曹雨金,唐仁泓．準(zhǔn)分子激光原位角膜磨鑲術(shù)前后淚液中生長(zhǎng)因子水平與淚膜穩(wěn)定性的相關(guān)性分析[J]．中國(guó)實(shí)用眼科雜志,2007,25(9): 992-994．

[4]范玉香,馬景學(xué),崔會(huì)來(lái),等．神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)兔準(zhǔn)分子激光角膜磨鑲術(shù)后角膜神經(jīng)再生的作用研究[J]．中華眼科雜志,2007,43(4):367-370．

[5] Pepose J S,Johnson E M Jr．Is there a role for neurotrophin treatment of the ocular surface following laser in situ keratomileusis (LASIK)[J]?Am J Ophthalmol,2005,139(6):965-971．

[6]Lee H K,Lee K S,Kim H C,et al．Nerve growth factor concentration and implications in photorefractive keratectomy vs laser in situ keratomileusis[J]．AmJ Ophthalmol,2005,139(6):965-971．

[7]You L,Kruse F E,Volcker H E．Neurotrophic Factors in the Human Cornea[J]．IOVS,2000,41(3):692-702．

[8]Lee H K,Lee K S,Kim H C,et al．Nerve growth factor concentration and implications in photorefractive keratectomy vs laser in situ keratomileusis[J]．AmJ Ophthalmol,2005,139(6):1090-1094．

[9]Joo M J,Yuhan K R,Hyon J Y,et al．The effect of nerve growth factor on corneal sensitivity after laser in situ keratomileusis[J]．Arch Ophthalmol,2004,122(9):1338-1341．

[10] Aloe L,Tirassa P,Lambiase A．The topical application of nerve growth factor as a pharmacological tool for human corneal and skin ulcers Pharmacol Res[J]．Pharmacol Res,2008,57(4):253-258．

[11]Micera A,Lambiase A,Puxeddu I,et al．Nerve growth factor effect on human primaryfibroblastic-keratocytes:possible mechanism during corneal healing[J]．Exp Eye Res,2006,83(4):747-757．

[12] Coassin M,Lambiase A,Costa N,et al．Efficacy of topical nerve growth factor treatment in dogs affected by dry eye[J]．Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2005,243(2):151-155．

Effect of nerve growth factor on expression of TrkA in cornea after LASIK or Epi-LASIK

NGF TrkA LASIK Epi-LASIK Xeroma

2012-10-19）

（本文編輯：沈昱平）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2006A07）

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