陳家魯

白康沖劑為臨床科研實(shí)踐中篩選出來的一組療效好，毒副作用小的組方，使用現(xiàn)代制藥工藝精制而成，在臨床使用中取得了較好的效果，目前為南京軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院院內(nèi)制劑。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為白癜風(fēng)可能是肝腎陰虛、神智內(nèi)傷、肝氣郁結(jié)、氣機(jī)不暢，復(fù)感風(fēng)邪，搏結(jié)于肌膚以致局部氣血失和而發(fā)病，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)越來越多的認(rèn)為白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)理與自身免疫有關(guān)，本處方是針對白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)理加以研究篩選而來。該處方是以制首烏20 g、女貞子10 g、丹參15 g、黃芪20 g、白癬皮10 g和當(dāng)歸15 g六味中藥組成的復(fù)方制劑，具有滋補(bǔ)肝腎、活血化瘀等功效，臨床上用于治療白癜風(fēng)。為有效地控制本制劑的質(zhì)量，本文對白康沖劑中丹參的丹參酮I以及當(dāng)歸中的齊墩果酸采用薄層色譜法(Thin layer chromatography, TLC)進(jìn)行定性鑒別研究，采用高效液相色譜法(High performance liquid Chromatography, HPLC)對白康沖劑中制首烏中的大黃素的含量測定方法進(jìn)行研究，并對方法學(xué)進(jìn)行考察，以制訂該制劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1　儀器與試藥

1.1　儀器

Waters高效液相色譜系統(tǒng)(美國waters公司，2695溶劑管理系統(tǒng)，四元數(shù)碼梯度泵，2489紫外—可見檢測器，Empower 3單系統(tǒng)色譜工作站)，Milli-Q純水發(fā)生器(美國millipore公司)，電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)，KQ-100型超聲波提取器(江蘇昆山)。

1.2　試藥

丹參酮I對照品、齊墩果酸對照品及大黃素對照品購自中國食品藥品檢定研究院；制劑所用藥材購自安徽亳州義和堂中藥飲片有限公司，制首烏由藥商按《中華人民共和國藥典》2010版(一部)方法炮制；白康沖劑(10 g/袋)為醫(yī)院臨床應(yīng)用方，由本院制劑室自制(批號20120902)；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1　性狀

本品為棕色或棕褐色的顆粒；味甜，微苦。

2.2　定性鑒別

丹參：稱取白康沖劑(批號20120902)約5 g，加入乙醚約50 ml，攪拌浸提3小時(shí)，濾過，濾液蒸去溶劑，加入乙酸乙酯5 ml，溶解，濾過，濾液為供試液；另取丹參酮I對照品，加入乙酸乙酯制成每1 ml含2 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法[1]試驗(yàn)，吸取上述二種溶液各5 μl，分別點(diǎn)與統(tǒng)一硅膠G薄層板上，以石油醚—乙酸乙酯(8∶2)為展開劑，展開，取出晾干。于紫外燈下(365 nm)觀察，供試品色譜中，在與對照品相應(yīng)的位置上，顯相同的天藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。

當(dāng)歸：取白康沖劑(批號20120902)約5 g，加入氯仿約50 ml，置水浴上回流2小時(shí)，濾過，濾液蒸去溶劑，加入乙醇1 ml，溶解，濾過，濾液為供試液；另取齊墩果酸對照品，加入乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述二種溶液各20 μl，分別點(diǎn)與統(tǒng)一硅膠G薄層板上，以石油醚—氯仿—乙酸(10∶10∶2)為展開劑，展開，取出晾干。置碘缸中，供試品色譜中，在與對照品相應(yīng)的位置上顯黃色斑點(diǎn)。

2.3　樣品液制備

2.3.1白康沖劑供試液制備取白康沖劑(批號20120902)1袋，精密稱取，加三氯甲烷約80 ml，稱定，80 ℃加熱回流60分鐘，冷卻，用三氯甲烷補(bǔ)足損失的重量，搖勻并過濾，精密量取50 ml，蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相[甲醇—0.1mol/L磷酸溶液(8∶2，調(diào)節(jié)pH=3.0)]溶解，過0.45 μm微孔濾膜后用流動(dòng)相定容于100 ml容量瓶中，備用[2]。

2.3.2對照品溶液的配制精密稱取大黃素對照品約20 mg，用流動(dòng)相溶解并定溶于100 ml容量瓶中，并等比稀釋成 0.203 mg/ml、0.102 mg/ml、0.0508 mg/ml、0.0254 mg/ml及0.0127 mg/ml 的系列濃度溶液，備用。

2.4　含量測定

2.4.1色譜柱條件及可行性考察色譜柱為Global Chromatography C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相為甲醇—0.1 mol/L磷酸溶液(8∶2，調(diào)節(jié)pH=3.0)；流速1.0 ml/min；檢測波長254 nm；靈敏度0.05 AUFS；柱溫25 ℃。在上述條件下，樣品中大黃素達(dá)基線分離，陰性對照顯示無干擾，見圖1。

2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線量取系列濃度的對照品溶液分別進(jìn)樣20 μl，以進(jìn)樣量(X)對峰面積(Y)回歸，擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為：Y=4534328.2X+342888.7，r=0.9999，結(jié)果表明在0.2537～4.06 μg范圍內(nèi)線形關(guān)系良好，見表1。

表1　線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4.3精密度測試分別在0小時(shí)、1小時(shí)、4小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)內(nèi)以及1天、2天、3天、4天、5天內(nèi)取同一批次配制的大黃素對照品溶液進(jìn)樣，測其峰面積，分別考察日內(nèi)、日間的精密度。結(jié)果顯示日內(nèi)、日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)分別為1.79%和2.44%，結(jié)果表明該方法具有良好的精密度。

2.4.4穩(wěn)定性考察分別在0小時(shí)、1小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、12 小時(shí)精密量取對照品溶液進(jìn)樣，測其峰面積，計(jì)算出RSD=0.97%，結(jié)果表明大黃素在該甲醇—磷酸水溶液中12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5回收率實(shí)驗(yàn)精密量取已測含量的同一批號白康沖劑制劑(批號20120902)樣品6份，分別加入大黃素對照貯備液適量，按樣品提取方法制得樣液，按樣品測定項(xiàng)下方法進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)，測得平均回收率為101.10%，RSD為2.53% (n=6)。結(jié)果見表2。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5　制劑含量測定

精密量取上述的白康沖劑(批號20120902)制劑提取液20 μl連續(xù)進(jìn)樣5次，測得其平均面積為4297647 mV*min，計(jì)算得該批號的白康沖劑中大黃素的含量為4.361 mg/10 g。

3　討論

薄層法(TLC)鑒別中成藥因不受藥材在成藥中存在狀態(tài)的限制(顯微鑒別要求藥材以粉末狀態(tài)存在)，也不受存在量的限制(顏色反應(yīng)則需要一定的有效成分濃度，濃度低，顏色反應(yīng)結(jié)果不明顯，易判斷失誤)，可有效的進(jìn)行定性研究。因此，TLC與其它鑒別方法相比有其自身的優(yōu)越性，在鑒別中成藥方面有著廣闊的前景。本文選用TLC法對制劑組方中丹參中的丹參酮I和當(dāng)歸中的齊墩果酸進(jìn)行了定性的鑒別。

石嶺等[3]報(bào)道選用正己烷、乙酸乙酯、乙醚等溶劑對丹參中的丹參酮進(jìn)行浸泡提取，結(jié)果表明乙醚不僅對丹參酮溶解性大，而且對其他成分提取少，可以更高效的提取丹參酮。參照文獻(xiàn)，通過對溶劑的初步篩選，本文選擇了乙醚作為丹參中丹參酮I的TLC檢測的提取溶劑。

張秋紅等[4]綜述了多種藥材中齊墩果酸的提取工藝，其中氯仿應(yīng)用最為廣泛，并有較好的效果，參照文獻(xiàn)，通過對溶劑的初步篩選，本文選用了氯仿作為當(dāng)歸中齊墩果酸的TLC檢測的提取溶劑。

蒽醌類化合物是何首烏中主要活性成分之一，臨床上研究中具有多種藥效。其中大黃素是蒽醌類化合物的成分之一，因此本研究以大黃素為研究對象，對白康沖劑進(jìn)行含量測定方法學(xué)研究。雖然大黃素為親脂性化合物，但用極性較小的溶劑如甲醇提取何首烏藥材時(shí)，并不能完全提取大黃素；文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]大黃素分別用甲醇和三氯甲烷作為提取液提取時(shí)，三氯甲烷不僅可以提高提取效率，而且提出溶液中干擾較少，因此，本文選擇用三氯甲烷提取制劑中的大黃素，揮干后用流動(dòng)相定容制備供試液。

本文建立了白康沖劑中大黃素的含量測定方法，并對方法學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，該方法為白康沖劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供了依據(jù)。

[1]國家藥典委員會(huì). 中華人民共和共國藥典(一部)[S]. 北京: 中國醫(yī)藥科技出版社, 2010: 附錄VI B 34.

[2]趙沈娟,黃新蘭,石晶萍,等. RP-HPLC法測定不同產(chǎn)地首烏藤中大黃素[J]. 中國藥師, 2008, 11(9): 1063-1064.

[3]石嶺,魚紅閃,金鳳燮. 丹參藥渣中丹參酮的提取研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(9): 4536-4541.

[4]張秋紅,劉素清,熊紹根. 齊墩果酸成分薄層分析條件綜述[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥, 2000,11(5): 467-468.

[5]楊潔,顧蘇俊,趙夕. 升黃克痛軟膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J]. 科學(xué)技術(shù)與工程,2008，18(17): 4969-4972.

[6]張郁蔥,丁德榮,龍湘俊,等. 高效液相色譜法測定虎梅沖劑中大黃素和大黃素甲醚含量研究[J]. 湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2002,22(2): 24-26.